兩種油葵自交系再生體系的建立

周茜萍，王夢瑤，呂新華，祝建波，孫黎

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003)

兩種油葵自交系再生體系的建立

周茜萍，王夢瑤，呂新華，祝建波，孫黎

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003)

【目的】取兩種自交系油葵(1538-3和1573-2)的不同外植體，建立組織再生培養(yǎng)體系，選出最適品系，為遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。【方法】分別取兩種自交系油葵的不同組織，采用不同激素配比，從器官間接和直接發(fā)生兩個方面分別誘導(dǎo)油葵不定芽再生。【結(jié)果】以油葵自交系1538-3的不同外植體為材料，在含有1-萘乙酸(NAA)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、激動素(KT)的培養(yǎng)基中都易形成愈傷組織，但均表現(xiàn)為白色、水漬化程度高，無分化能力；6-BA濃度在0～1.0 mg/L時，子葉節(jié)可誘導(dǎo)出不定芽，其他激素配比中未見此現(xiàn)象；以胚軸為外植體時，油葵1573-2自交系不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS + 0.6 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L GA3；1538-3自交系不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L GA3；兩種自交系誘導(dǎo)不定芽生根時NAA的最佳濃度為0～0.2 mg/L。【結(jié)論】兩種基因型油葵誘導(dǎo)不定芽的能力差別較大，其中自交系1538-3再生能力較強(qiáng)，遺傳轉(zhuǎn)化時選用1538-3的胚軸作為轉(zhuǎn)化受體時較好。

油葵；胚軸；組織培養(yǎng)；再生體系

0 引 言

【研究意義】油葵為油用向日葵(HelianthusannuusL.)的簡稱，是菊科向日葵屬植物。油葵是世界四大油料作物之一，也是我國北方主要食用油的植物來源。利用現(xiàn)代生物技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的油葵新品種已成為越來越多育種者的目標(biāo)，而離體培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)中改造并培育優(yōu)良油葵品種的重要途徑。【前人研究進(jìn)展】20世紀(jì)80年代，對向日葵離體培養(yǎng)進(jìn)行了研究，主要以器官發(fā)生[1-4]和胚胎發(fā)生[5-7]為主，利用莖尖[8]、子葉[9]、真葉[10]、下胚軸[11]、未成熟胚[12]等不同程度地得到胚狀體或植株。向日葵是公認(rèn)的難再生植物，加上基因型[13]、內(nèi)外源激素、外植體類型的差異，使得油葵組織培養(yǎng)再生研究僅在有限的基因型上獲得成功[14]。徐培洲[9]和Paterson[15]等研究結(jié)果表明，不含2,4-D是獲得胚性愈傷組織的必要條件。【本研究切入點】向日葵難轉(zhuǎn)化的原因是從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織再生植株困難，研究以兩種油葵自交系為材料，以子葉、子葉節(jié)和胚軸為外植體，探討不同激素水平對油葵愈傷組織分化的影響，從器官發(fā)生途徑進(jìn)行了不定芽誘導(dǎo)再生實驗。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究從愈傷組織建立油葵再生體系的可能性，以提高油葵的轉(zhuǎn)化與再生效率，為油葵的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

兩個油葵自交系1538-3和1573-2由新疆農(nóng)墾科學(xué)院提供。

1.2 方 法

1.2.1 油葵無菌苗的獲得

挑選顆粒飽滿，無病蟲害的種子50粒，去殼后用75%酒精震蕩消毒3 min，無菌水沖洗1次，再用2%次氯酸鈉震蕩消毒5～6 min后，用無菌水沖洗4次，然后接種于MS培養(yǎng)基上。

1.2.2 胚軸外植體的準(zhǔn)備

胚軸外植體的準(zhǔn)備參考劉宇新[16]的方法。

表1 不同KT、NAA和6-BA激素濃度配比

1.2.3 KT、NAA和6-BA激素濃度的配比

以MS為基本培養(yǎng)基，參考楊長友[17]的方法，以不同濃度的KT、NAA和6-BA進(jìn)行試驗，以獲得最佳的愈傷誘導(dǎo)激素配比。表1

1.2.4 6-BA與GA3激素濃度的配比

根據(jù)劉宇新等[16]的方法，以MS為基本培養(yǎng)基，分別以0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L GA3與0.2、0.4、0.5、0.6 mg/L 6-BA進(jìn)行正交組合。

1.2.5 不同NAA激素濃度對油葵胚軸再生苗生根的影響

待培養(yǎng)基中分化出的小苗長至3 cm左右時切下，接種于附加不同濃度NAA(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L)的生根培養(yǎng)基中。每瓶選1～3個芽接種，實驗重復(fù)五次，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計生根數(shù)和生根率。實驗中所用的MS固體培養(yǎng)基含瓊脂7.0 g/L，蔗糖濃度為30 g/L，培養(yǎng)基pH為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，12 h光照/12 h黑暗。愈傷組織與分化試驗每組處理3個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿放8～10個材料，每組重復(fù)3次，接種后第20與第40 d后分別統(tǒng)計子葉、子葉節(jié)的愈傷生長情況；接種后24 d統(tǒng)計不定芽分化情況。表2

表2 不同GA3和6-BA激素濃度配比

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計結(jié)果、繪圖用Excel分析完成，試驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。參數(shù)的計算方法如下：

子葉節(jié)芽誘導(dǎo)率=長芽的子葉節(jié)數(shù)/接種的子葉節(jié)數(shù)×100%。

胚軸分化率=分化的胚軸數(shù)/接種的胚軸數(shù)×100%。

生根率=長根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度KT、NAA和6-BA對油葵子葉和子葉節(jié)愈傷誘導(dǎo)的影響

油葵1538-3自交系在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)20和40 d后不同組織的愈傷生長情況表明，當(dāng)以子葉為外植體時，以上21種添加不同激素的培養(yǎng)基上都可以誘導(dǎo)出愈傷，但無胚性愈傷組織。在愈傷誘導(dǎo)初期，大多數(shù)表現(xiàn)為外植體稍膨大，愈傷呈現(xiàn)黃綠色或淺黃綠色，水漬化程度高，質(zhì)地蓬松。經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)之后愈傷已呈現(xiàn)無分化能力的菌絲狀物。以子葉節(jié)為外植體在21種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的愈傷生長狀況與子葉的大致相同，呈淺黃色或白色，手感蓬松；經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)后，個別愈傷呈稀泥狀組織，水漬化程度加深，失去了繼續(xù)分化為胚性愈傷的能力。

在試驗過程中發(fā)現(xiàn)6-BA濃度在0、0.5和1.0 mg/L時，子葉節(jié)可以分化出不定芽，分化率分別為66.67%、30%和15%，且6-BA濃度越低，分化率越高。NAA濃度在0或0.1～1.0 mg/L時，子葉節(jié)可誘導(dǎo)出芽點或者生長點處有葉分化。通過誘導(dǎo)不定芽的最佳激素配比為1.0 mg/L KT + 0.1 mg/L NAA + 0 mg/L 6-BA或 0.5 mg/L 6-BA。表3

表3 不同激素配比對不同外植體愈傷生長情況

2.2 不同濃度GA3和6-BA對油葵胚軸不定芽誘導(dǎo)的影響

為進(jìn)一步了解6-BA對油葵胚軸不定芽誘導(dǎo)的影響，根據(jù)劉宇新等[16]的方法，以兩種油葵自交系的胚軸為外植體，進(jìn)一步研究了不同激素配比對油葵不定芽誘導(dǎo)的影響。研究表明，兩種油葵自交系1538-3和1573-2在16種培養(yǎng)基中不定芽分化率最高為100%，最低為33.33%，平均不定芽誘導(dǎo)率分別為81.47%和60.68%。圖1

圖1 不同激素配比下兩種油葵不定芽分化變化

對于1573-2來說，當(dāng)6-BA濃度大于0.5 mg/L時，胚軸分化呈增加趨勢，在0.6 mg/L時達(dá)到最大，分化率達(dá)到83.33%，隨著附加物GA3濃度的增加，分化率降低。因此1573-2的胚軸分化最佳培養(yǎng)基配比為MS + 0.6 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L GA3。對于1538-3來說，隨著6-BA濃度的升高，不定芽分化率也隨之增加，在0.4 mg/L時達(dá)到最大；而后隨著6-BA濃度的升高，不定芽分化數(shù)反而降低；同時在實驗中發(fā)現(xiàn)有些培養(yǎng)基組合雖然能強(qiáng)烈誘導(dǎo)不定芽的生長，但生長狀態(tài)不理想(圖2A)，表現(xiàn)為叢生芽數(shù)過多，幼芽高度下降，莖稈畸形，不易在生根培養(yǎng)基上成苗。因此1538-3的胚軸分化最佳培養(yǎng)基配比為MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L GA3。圖2

A:1538-3；B:1573-2

圖2 GA3和6-BA對自交系誘導(dǎo)不定芽的影響(誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d)

Fig.2 Effect of the concentration of GA3and 6-BA on shoot regeneration of inbred lines(Induced culture for 20 days)

2.3 不同基因型不同外植體對向日葵子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率的影響

以1573-2和1538-3油葵自交系成熟種子的胚軸為材料，在上述不同濃度6-BA與GA3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化。研究表明，2種基因型不定芽誘導(dǎo)率依次為1538-3>1573-2。方差分析結(jié)果表明：不同基因型之間不定芽誘導(dǎo)率存在極顯著差異(P<0.01)。圖2，表4

表4 兩個基因型對不定芽誘導(dǎo)率的差異顯著性測驗

2.4 不同濃度NAA對油葵胚軸再生苗生根影響

研究表明，兩種自交系在不添加NAA或NAA濃度較低的1/2 MS培養(yǎng)基中均能不同程度地誘導(dǎo)油葵不定芽生根。對于自交系1573-2來說，在不含NAA的1/2 MS培養(yǎng)基上，一般從第10 d就可見根的分化，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，根表現(xiàn)為根系細(xì)弱，根系不發(fā)達(dá)，移栽后不易成活；NAA濃度在0.2和0.4 mg/L時，不定芽生根有延遲現(xiàn)象，但一般從第15 d開始，激素誘導(dǎo)不定根分化明顯，表現(xiàn)為根系量大，根系粗壯(圖3B)。對于1538-3來說，在不同生根培養(yǎng)基中根的生長狀況與1573-2相似，但是NAA濃度為0 mg/L時，它的生長狀況最好(圖3A)，隨著激素濃度的升高，NAA濃度在0.2 mg/L時，其生根率快速下降，無生根植株表現(xiàn)為在根部分生區(qū)有愈傷組織的大量生長，這可能與油葵本身的內(nèi)源激素高有關(guān)[18]。確定1573-2油葵生根最佳培養(yǎng)基為1/2 MS + 0.2 mg/L NAA ，1538-3油葵生根最佳培養(yǎng)基為1/2 MS + 0 mg/L NAA。圖3，表5

表5 不同濃度NAA下生根情況

A、D：1538-3；B、C：1573-2;

圖3 油葵再生苗生根與移栽

Fig.3 Rooting and transplanting of the sunflower’s regeneration plantlets

3 討 論

3.1 不同激素對油葵外植體再生的影響

在植物組織培養(yǎng)中，植物激素的類型及其在培養(yǎng)基中添加的比例是影響外植體是否再生的重要因素。梁國婷[19]對模式植物擬南芥離體器官的再生研究表明，培養(yǎng)基中生長素(2,4-D、IAA和NAA)與細(xì)胞分裂素(6-BA、Zeatin)的濃度比例高時易于誘導(dǎo)根的形成，低時促進(jìn)芽的分化。勾暢等[20]用菊花花瓣作為外植體，不形成愈傷組織，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，縮短了培養(yǎng)周期。在實驗中，培養(yǎng)基中添加NAA、KT、6-BA和GA3均能不同程度地誘導(dǎo)出不定芽，在NAA、KT和6-BA組合中，6-BA不添加或者濃度很低時才能誘導(dǎo)出不定芽，這與Paterson等[15]的研究結(jié)果相似。Pugliesi等[1]的研究結(jié)果表明，KT和IAA對植株再生是必須的，當(dāng)其比值(KT/IAA)達(dá)到4∶1時，再生頻率最高。在其選用的5個材料中，不論遺傳組成如何，在補(bǔ)加KT(4 mg/L)和IAA(0.1 mg/L)的MS培養(yǎng)基中均能再生。在6-BA和GA3激素組合中，較低濃度的6-BA和GA3均能誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生。在愈傷誘導(dǎo)過程中，雖然子葉節(jié)周緣產(chǎn)生不定芽，但未觀察到胚性愈傷組織形成，這可能與激素配比、外植體選擇和植物自身激素水平等因素有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同基因型向日葵對外植體再生的影響

研究表明，植物基因型的差異對其再生頻率有顯著的影響。Vanegas等[21]以萬壽菊葉片為材料，在MS附加IAA和6-BA的培養(yǎng)基上不定芽的誘導(dǎo)率最高可達(dá)69.4%。齊迎春等[22]則建立了五種不同基因型孔雀草的再生體系，并且發(fā)現(xiàn)五種孔雀草在同種培養(yǎng)基上的再生率均不同。這些結(jié)果說明了基因型差別越大，對外源激素的種類和含量的需求差異越明顯。劉寶等[13]對51份向日葵自交系材料進(jìn)行了離體培養(yǎng)，其中16份自交系獲得了再生芽。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)植株再生能力存在顯著的基因型間的差異。Paterson等[15]對100個向日葵自交系的莖尖組織在加有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上進(jìn)行了培養(yǎng)，其中54%的基因型發(fā)生不同程度的再生現(xiàn)象。研究也發(fā)現(xiàn)，不同基因型自交系油葵在芽誘導(dǎo)方面存在差異，自交系1538-3不定芽誘導(dǎo)率顯著高于自交系1573-2。但Pugliesi等[1]則持不同的觀點，認(rèn)為基因型與植物再生能力之間無明顯關(guān)系，而與生長素與細(xì)胞分裂素的配比有關(guān)。

4 結(jié) 論

向日葵作為難再生植物，許多內(nèi)源或外源因素影響其離體植株再生過程。研究探討了激素類型、外植體類型及基因型對油葵離體組織再生的影響。油葵子葉和子葉節(jié)在不同激素誘導(dǎo)愈傷組織過程中的差異不大。通過幾次繼代培養(yǎng)，愈傷組織均表現(xiàn)為質(zhì)地蓬松、水漬化程度高，失去分化能力。在激素配比為1.0 mg/L KT + 0.1 mg/L NAA + 0 mg/L 6-BA或0.5 mg/L 6-BA時，子葉節(jié)可誘導(dǎo)出不定芽。不同濃度配比的6-BA和GA3對油葵1573-2和1538-3不定芽誘導(dǎo)的分化率也不同，后者高于前者。在遺傳轉(zhuǎn)化時可以選用不定芽再生率較高的1538-3作為轉(zhuǎn)化受體。

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Establishment of Regeneration System of Two Types Inbred Lines from Oil Sunflower (HelianthusannuusL.)

ZHOU Xi-ping, WANG Meng-yao, Lü Xin-hua, ZHU Jian-bo, SUN Li

(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003, China)

【Objective】 The explants of two inbred oil sunflower (1538-3 and 1573-2) were used to establish the tissue regeneration culture system, and the optimum strain was selected to lay the foundation for genetic transformation.【Method】Two different inbred lines of oil sunflower were taken respectively, and the regeneration of adventitious bud of oil sunflower was induced from two aspects of indirect and direct organs by different hormone ratio.【Result】The results showed that inbred lines 1538-3 was easy to form callus in the mediums containing NAA, 6-Benzylaminopurine (6-BA) and kinetin (KT), but all the callus were white with high water damage level. The sunflower cotyledonary node could induce adventitious buds when the concentration of 6-BA was 0 to 1.0 mg/L, which couldn't be observed in other hormone combinations. The combination of MS + 0.6 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L GA3was most suitable for the induction of adventitious bud from inbred lines 1573-2 hypocotyls explants. While for inbred line 1538-3, the most suitable medium was MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L GA3. The best concentration of NAA for inducing the root of adventitious buds ranged from 0 to 0.2 mg/L in both inbred lines.【Conclusion】The ability of the two genotypes of oil sunflower to induce adventitious bud is different. Among them, the inbred line 1538-3 has stronger regeneration ability, and it is better to choose the 1538-3 axis as the transformation receptor in the genetic transformation.

HelianthusannuusL.; hypocotyl; tissue culture; regeneration system

SUN Li (1971- ), female, Native place: Shanxian, Shandong. Associate Professor, Research field: Plant physiology and molecular biology. (E-mail) sunlishz@126.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.07.005

2017-03-24

國家自然科學(xué)基金項目“油葵DGAT1和DGAT2基因調(diào)控含油量和脂肪酸組分的分子機(jī)制”(31360052)

周茜萍(1990-)，女，甘肅武威人，碩士研究生，研究方向為基因資源的研究與評價，(E-mail)zxpshzu@163.com

孫黎(1971-)，女，山東單縣人，副教授，研究方向為植物生理與分子生物學(xué)，(E-mial)sunlishz@126.com

S565.4

A

1001-4330(2017)07-1208-08

Supported by: the National Natural Science Foundation of China "Molecular Mechanism of DGAT1 and DGAT2 from Sunflower in Regulating Oil Content and Fatty Acid Composition" (31360052)