卵泡刺激素功能肽與受體胞外區(qū)不同片段結(jié)合作用的分析

趙婷，席歐彥，秦瑞坪，邱玲玲，馬曉玲，李江偉

(新疆大學生命科學與技術(shù)學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

卵泡刺激素功能肽與受體胞外區(qū)不同片段結(jié)合作用的分析

趙婷，席歐彥，秦瑞坪，邱玲玲，馬曉玲，李江偉

(新疆大學生命科學與技術(shù)學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

【目的】卵泡刺激素(FSH)33-53肽可以與FSH受體(FSHR)結(jié)合,并激活下游信號，被作為FSH功能肽。然而其在受體上的具體結(jié)合位置還不清楚。闡明FSH33-53肽在FSHR上的結(jié)合區(qū)域，為基于FSH的疫苗設(shè)計提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎弥亟M的FSHR 胞外區(qū)(ECD)和富含亮氨酸區(qū)(LRR)及合成的FSHR9-30區(qū)分析這些FSHR的功能區(qū)域與FSH33-53的結(jié)合作用。PCR擴增得到hFSHR ECD和hFSHR LRR目的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-ECD和pET22b-FSHR-LRR，表達純化獲得蛋白FSHR-ECD和FSHR-LRR。采用多肽合成法獲得FSHR9-30-KLH。通過ELISA方法檢測受體片段與FSH33-53肽的結(jié)合和親和力。【結(jié)果】獲得FSHR-ECD和FSHR-LRR蛋白，其相對分子質(zhì)量(Mr)分別為43和32kDa。在受體為0.5 μgmL，配體為2.5 μgmL時，三種蛋白均與FSH33-53肽結(jié)合。ELISA檢測受體與配體的親和力分別為0.21×10-6、0.45×10-6和0.056×10-6mol/L 。【結(jié)論】FSHR 9-30片段與FSH33-53肽的結(jié)合較其它兩個片段結(jié)合力強。

FSH33-53肽；LRR；FSHR9-30肽；胞外區(qū)；親和力

0 引 言

【研究意義】卵泡刺激素(Follice stimulating hormone, FSH)屬于腺垂體分泌的糖蛋白激素，其作用是促進卵泡生長和成熟，也是治療不孕癥的常用藥物[1-2]。卵泡刺激素受體(Follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)為七次跨膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。FSHR有695個氨基酸組成，分別有胞外區(qū)(extracellular domain，ECD)、胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain，ICD)和跨膜區(qū)組成。只有受體與配體結(jié)合才能對生理功能產(chǎn)生一定的作用，測定配體與受體親和力的結(jié)合實驗是藥物評價、研發(fā)和作用機理研究中不可缺少的部分[3]。針對FSH33-53肽結(jié)合作用的研究為靶向卵泡刺激素藥物和疫苗的開發(fā)提供新的解決途徑?！厩叭搜芯窟M展】作為靶向藥物的研究要滿足其只在生殖系統(tǒng)中表達，其次盡量減少副作用[4-5]。當前研究FSH的片段有1-15、33-53、51-65和81-95，其中33-53和81-95肽參與受體的識別和結(jié)合較好[6]。近年來報道卵泡刺激素不僅能夠在生殖上研究不孕癥，還可在動物脂肪代謝分子機制中產(chǎn)生影響[7-8]。在研究FSH靶向藥物的研究中，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的半衰期較短，不足以達到治療的目的，延長其在體內(nèi)的時間可以通過偶聯(lián)一些拮抗劑或者能更有效的通過結(jié)合位點的方法[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c】與FSH全長結(jié)合的高親和力位點，如18-366(ECD)、18-259(LRR)肽段。在研究FSHR不同肽段時發(fā)現(xiàn)FSHR9-30在激素結(jié)合中起到很重要的作用[11]。使用這些重要的肽段研究與FSH33-53肽的結(jié)合情況，能夠有效的靶向于激素結(jié)合位點，更有效的去開發(fā)一些針對FSH33-53肽的藥物或疫苗?！緮M解決的頭飾問題】鑒于以上介紹研究中選用配體FSH的33～53多肽和hFSHR ECD、hFSHR LRR和hFSHR9-30作為研究的材料，試驗中初步獲得FSHR的胞外區(qū)、N端的9-30和LRR，得到這三個不同肽段的蛋白同時制備抗多肽抗體，用FSHR胞外區(qū)的不同肽段測定與FSH33-53肽的結(jié)合力，通過計算公式獲得這三個肽段的親和力，為后續(xù)實驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

原核表達載體pET22b和pDisplay-AP-FSHR質(zhì)粒為實驗室保存。FSH33～53-biotin和FSHR9-30-KLH由上海吉爾生化有限公司合成。pDisplay-AP-FSHR是由北京大學化學與分子工程學院饋贈。ExTagpolymerase,限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和NotⅠ和T4連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和純化回收試劑盒均購自O(shè)mega公司。Ni SepharoseTM6 Fast Flow購自GE Healthcare 公司。Bradford 蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。兔抗FSHR多抗為SIGMA-ALDRICH公司產(chǎn)品，HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG為康偉公司出品。完全弗式佐劑和不完全弗式佐劑購自 Sigma中國公司。ECL顯色液購自Beyotime生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-ECD和pET22b-FSHR-LRR的構(gòu)建

在NCBI中查找人fshr的基因及氨基酸序列，經(jīng)DNAman軟件分析獲得FSHR的ECD和LRR。分別設(shè)計FSHR的ECD和LRR區(qū)的PCR引物：FSHR-ECD-P 1，5'-catgCCATGGGATGTCATCATCGGATCTGTCACTG-3'和FSHR-ECD-P2，5'-ata agaatGCGGCCGCGACTCTGAGGATGTTGTACCCCA-3'；FSHR-LRR-P1，5'-catgCCATGGGATGTCATCATC GGATCTGTCACTG-3'和FSHR-LRR-P2，5'-ataagaatGCGGCCGCTTCCAGAGTAGGCAGCTTTTTTA -3'擴增目的基因ECD和LRR，PCR產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切后，與載體pET22b連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化子涂布在LB固體培養(yǎng)皿中，次日挑取單克隆，提取質(zhì)粒，在通過NcoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，之后送公司進行測序分析。

1.2.2 目的蛋白的表達與純化

用包涵體溶解緩沖液溶解包涵體，超聲破碎儀獲得粗蛋白的上清與沉淀，沉淀使用6 M尿素溶解，鎳柱親和層析純化，從低到高的咪唑濃度洗脫蛋白，咪唑濃度依次為10 mM、20 mM、20 mM、40 mM、40 mM、120 mM和500 mM。以此獲得純度較高的蛋白，通過超濾獲得濃度較高的FSHR-ECD和FSHR-LRR蛋白，之后經(jīng)Bradford 法測定濃度。

1.2.3 western blot鑒定蛋白FSHR ECD和FSHR LRR

用western bolt檢測目的蛋白的特異性。Western blot中的一抗采用用SIGMA-ALDRICH公司的兔抗FSHR多抗，稀釋比例為1∶800；二抗采用康偉公司的HRP-羊抗兔IgG，稀釋比例1∶5 000，ECL顯色，在Las4000儀器中檢測。

1.2.4 ELISA試驗檢測FSHR ECD、FSHR LRR和FSHR9-30與FSH33-53肽的結(jié)合

在96孔板中分別包被蛋白FSHR ECD、FSHR LRR和FSHR9-30，濃度為0.5 μg/mL,陰性孔為BSA，濃度為0.5 μg/mL，4℃過夜。然后加入PBST洗3遍，加入5%脫脂奶粉，37℃封閉2 h，之后用PBST洗，加入濃度為2.5 μg/mL的FSH33-53肽，37℃孵育1 h，之后用PBST洗板，加入1∶2 000稀釋的HRP-streptavidin作為二抗，TMB顯色，酶標儀中測定A450值。

1.2.5 非競爭ELISA檢測受體和配體的親和力

在96孔ELISA板中分別包被抗原濃度為0.5 μg/mL的FSHR ECD、FSHR LRR和FSHR9-30，4℃過夜后用PBST洗3遍，加入濃度梯度為0.2、0.8、1.2、2和2.5 μg/mL的FSH33-53-biotin肽，37℃孵育2 h后用PBST洗3遍，加入1∶2 000稀釋的HRP-streptavidin作為二抗，TMB顯色，酶標儀中測定A450值，陰性對照包被0.5 μg/mL的BSA，其余與實驗組處理相同。

1.2.6 非競爭EISA檢測受體與配體的親和力

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 hFSHR ECD和hFSHR LRR基因的擴增與酶切鑒定

以pDisplay-AP-FSHR質(zhì)粒為PCR模板，用特異性引物FSHR-ECD-P1和FSHR-ECD-P2、FSHR-LRR-P1和FSHR-LRR-P2擴增目的基因ECD和LRR，通過1%的瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果顯示，ECD和LRR基因片段大小分別為1 044 bp和723 bp，與預期市場計算大小一致，重組質(zhì)粒pET-22b-FSHR-ECD和pET22b-FSHR-LRR經(jīng)酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒含有1 044 bp和723 bp大小的插入片段，同時測序結(jié)果也表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖1

A：FSHR-ECD和FSHR-LRR的PCR擴增；M：DNA marker DL2000；1～2：FSHR-ECD和FSHR-LRR的PCR產(chǎn)物；B：重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-ECD的酶切鑒定；M：DNA markerDL5000；1：重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-ECD的酶切產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-ECD的酶切質(zhì)粒；C：重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-LRR酶切鑒定；M：DNA marker DL5000 ；1：重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-LRR的酶切質(zhì)粒；2：重組質(zhì)粒pET22b-FSHR-LRR的酶切產(chǎn)物

A：M：DNA markerDL2000；1,2：PCR products of hFSHR ECD and hFSHR LRR；B：M：DNA markerDL5000；1：digestion products of pET-hFSHR-ECD；2：recombinant plasmid of pET-hFSHR-ECD；C：M：DNA markerDL5000；1：digestion products of pET-hFSHR-LRR；2：recombinant plasmid of pET-hFSHR-LRR

圖1 重組蛋白FSHR-ECD和FSHR-LRR的PCR擴增和雙酶切鑒定

Fig.1 PCR for hFSHR ECDand hFSHR LRR and Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant plasmid

2.2 hFSHR ECD和hFSHR LRR蛋白的表達純化與鑒定

原核蛋白FSHR ECD和FSHR LRR經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，均以包涵體形式表達，在Mr約43×103、 32×103的位置分別有一條清晰的目的條帶，圖2(A)這兩種蛋白采用鎳柱親和層析法純化，將溶解的包涵體依次用不同濃度的咪唑洗脫，可獲得純度較高的蛋白。經(jīng)15%SDS-PAGE電泳檢測(圖2(B)和(C))，最終純化蛋白條件確定為20、40和200 mM咪唑。經(jīng)過多次純化獲得較純的蛋白FSHRECD和FSHRLRR(圖2D)，蛋白純度可達90%。通過western blot檢測獲得的重組蛋白ECD和LRR能夠與兔抗FSHR的多克隆抗結(jié)合(圖2(E))，條帶大小與預期的一致。圖2

A： FSHR ECD和FSHR LRR蛋白的誘導表達，M(14.4-116kDa)；1～4：分別為誘前、誘后、上清和沉淀；5～8：分別是誘前、誘后、上清和沉淀。B：M(14.4-116kDa)； FSHR ECD的純化；1：粗蛋白；2～9：分別是10、20、20、20、40、40、200、500 mmol/mL咪唑洗脫蛋白樣品；C：M(14.4-116kDa)； FSHR LRR的純化；1：粗蛋白；2～9：分別是10、20、20、20、40、40、200、500 mmol/mL咪唑洗脫蛋白樣品。D：M(14.4-94.0kDa)1：蛋白FSHR ECD；2：蛋白FSHR LRR。E：M(14-120kDa)1: FSHR LRR蛋白;2: FSHR ECD蛋白

A：Inducible expression of pET22b-FSHR-ECD and pET22b-FSHR-LRR.M(14.4-116);1-4：following 1:uninduced；2：induced；3：supernatant；4：precipitation.B: purification of FSHR ECD；1: FSHR-ECD protein；2-9:folloeing 10、20、20、20、40、40、200、500 mmol/mL to elution protein samples by Imidazole；C： purification of FSHR-LRR ；1: FSHR-LRR protein；2-9:following 10、20、20、20、40、40、200、500 mmol/mL to elution protein samples by Imidazole。D：Marker(14.4-94kDa)，1：FSHR ECD protein；2：FSHR LRR protein；E：Marker(14-120kDa)1：FSHR LRR protein，2：FSHR ECD protein

圖2 FSHR-ECD和FSHR-LRR蛋白的表達純化與鑒定

Fig.2 Purification of FSHR-ECD and FSHR-LRR protein Purification of pET22b-hFSHR-ECD and pET22b-hFSHR-LRR protein and identification of hFSHR ECD and hFSHR LRR by Western Blot

2.3 ELISA檢測FSHR不同片段與FSH33-53肽段結(jié)合作用

在含有FSHR-ECD、FSHR-LRR和FSHR9-30的三種肽段中分別加入FSH33-53肽，結(jié)果分析與對照相比FSHR的胞外區(qū)的不同肽段與FSH33-53肽均結(jié)合。 圖3

2.4 ELISA檢測FSH33-53肽與FSHR不同肽段的結(jié)合力

圖3 FSH33-53肽與FSHR胞外區(qū)不同肽段的結(jié)合

圖4 FSH33-53肽與FSHR的ECD、LRR和9-30肽結(jié)合的親和力測定

FSHR胞外區(qū)不同肽段親和力Kd(×10-6)FSHR-ECD0.21FSHR-LRR0.45FSHR9-300.056

3 討 論

FSHR是七次跨膜受體，其N端的胞外區(qū)是與配體特異結(jié)合較高的肽段。最初對于FSHβ鏈的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ鏈的1-15、33-53、51-65、81-95和101-111也參與受體的結(jié)合。同時對于FSHR的研究中發(fā)現(xiàn)LRR肽段和胞外區(qū)的絡(luò)氨酸都與FSH的結(jié)合有很大影響，在FSHR胞外區(qū)中的二硫鍵也影響著激素的結(jié)合[13-14]。了解FSHR的結(jié)構(gòu)和生物活性對于后續(xù)的研究是很有幫助的。在研究中探討了FSH33-53肽與FSHR的不同肽段的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)對于FSH33-53肽結(jié)合較強的受體肽段為9-30這一區(qū)域。

通過使用X-ray發(fā)現(xiàn)FSH和FSHR結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)研究中推測出許多重要的結(jié)合位點[15]，其中包括FSHR的胞外區(qū)，LRR區(qū)，連接胞外區(qū)和9-30區(qū)，這些肽段對于FSH的結(jié)合起關(guān)鍵性的作用，研究FSHR的不同肽段不僅僅局限于這些，如FSHR的172-257、221-252、285-300等[16]這些肽段對于FSH的結(jié)合都是有影響的。研究FSH的33-53和81-95肽段與FSHR結(jié)合的試驗中，得到FSH33-53和81-89這兩個肽段是比較有效的拮抗物[17]。在研究中選擇片段FSH33-53肽段，研究分析FSH33-53肽與FSHR ECD、FSHR LRR和FSHR9-30肽的結(jié)合。試驗中通過構(gòu)建獲得的FSHR-ECD和FSHR-LRR重組蛋白，通過ELISA結(jié)合試驗結(jié)果表明，F(xiàn)SHR ECD、FSHR LRR和FSHR9-30均與FSH33-53肽結(jié)合，說明FSH33-53肽可以識別FSHR的ECD、LRR和9-30區(qū)域，但各自的親和力大小不同，通過計算結(jié)合力大小說明對于FSH33-53肽段，其與受體的9-30區(qū)結(jié)合較強，因此可以初步說明FSHR9-30可以作為與FSH33-53激素親和較高的肽段，為針對FSH33-53肽的靶向藥物提供參考。

4 結(jié) 論

綜上所述，在研究中通過最終western blot檢測結(jié)果表明，獲得重組蛋白FSHR-ECD和FSHR-LRR，大小分別是43kDa和32kDa，同時通過公司合成獲得FSHR9-30的短肽。初步獲得了FSHR的ECD、LRR和9-30這三段肽段，并且通過ELISA檢測親和力實驗，結(jié)果表明，F(xiàn)SHR9-30是FSH33-53肽的一個結(jié)合較高的肽段，其結(jié)合力大小為0.056×10-6mol/L。這為將來設(shè)計對于FSH的避孕疫苗和靶向治療不孕癥提供一個理論依據(jù)。

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Analysis of the Binding Effect of Follicle Stimulating Hormone Peptide and Different Fragments of Extracellular Domain

ZHAO Ting，XI Ou-yan，QIN Rui-ping，QIU Lin-lin，MA Xiao-lin，LI Jiang-wei

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering / College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

【Objective】 The FSH33-53 peptide binds to its receptor FSHR and activates the downstream signal as a FSH functional peptide. However, its specific binding position on the receptor is unclear. The aim of this study is to elucidate the binding region of the FSH33-53 peptide on the receptor FSHR in the hope of providing a basis for FSH-based vaccine design.【Method】The extracellular domain(ECD)and leucine-rich repeat (LRR) of follicle-stimulating hormone receptor was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and constructed recombinant plasmids pET22b-FSHR-ECD and pET22b-FSHR-LRR. Protein FSHR-ECD and FSHR-LRR were obtained by expression and purification. FSHR9-30-KLH. was obtained by peptide synthesis, and binding and affinity of receptor fragments with FSH33-53 peptide were detected by ELISA method. 【Result】The proteins FSHR-ECD and FSHR-LRR were successfully expressed and purified and their relative molecular mass (MR) was 43 and 32kda., respectively. When the receptor was 0.5 μg / mL and the ligand was 2.5 μg / mL, the three proteins were bound to the FSH33-53 peptide. The affinity of ELISA to detect the ligand and ligand was 0.21 × 10-6, 0.45 × 10-6and 0.056 × 10-6mol / L, respectively.【Conclusion】The binding of LRR fragment to FSH33-53 peptide is stronger than that of the other two fragments.

FSH33-53 peptides; LRR; FSHR9-30 peptides; ECD，affinity

Li jiang-wei(1967-)，male，professor，research fild ：Molecular immunology.(E-mail) jwli67@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.07.014

2017-05-11

國家自然科學基金項目“抗卵泡刺激素受體納米抗體的制備及其在腫瘤分子顯像和抗血管治療中的作用”(81260333)

趙婷(1990-)，女 ，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學，(E-mail)183210738@qq.com

李江偉(1967-)，男，教授，研究方向為分子免疫學，(E-mail)jwli67@sina.com

S188；Q786

A

1001-4330(2017)07-1284-07

Supported by: National Natural Science Foundation of China "Preparation of Nano Antibody against Follicle Stimulating Hormone Receptor and Its Role in Tumor Molecular Imaging and Angiogenesis Therapy(81260333)