飼喂發酵棉粕肉牛牛糞中細菌數量及多樣性研究

梁敏，張文舉，張凡凡，陳寧，尹君亮

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，新疆石河子 832000)

飼喂發酵棉粕肉牛牛糞中細菌數量及多樣性研究

梁敏1，張文舉1，張凡凡1，陳寧2，尹君亮2

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，新疆石河子 832000)

【目的】研究飼喂發酵棉粕對安格斯肉牛牛糞中細菌數量及多樣性的影響。【方法】采用平板計數法計算細菌的數量；采用PCR技術對提出的DNA進行細菌16Sr DNA基因V6-V8區擴增，將PCR產物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。得到指紋圖譜特異性條帶切膠回收并進行克隆測序，通過BLAST鑒定細菌菌種。【結果】(1)試驗前期，C組和T組總細菌、大腸桿菌和乳酸菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組金黃色葡萄球菌差異不顯著(P>0.05)。試驗后期，C組和T組總細菌差異不顯著(P>0.05)；C和T組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和乳酸菌差異顯著(P<0.05)。(2)牛糞中存在的菌種有沙門氏菌(Salmonella)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、乳酸菌(Lactobacillus)、毛螺旋菌(Lachnospiraceae)、志賀菌(Shigella)、梭菌(Clostridium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸桿菌(Enterobacter)和腸球菌(Enterococcus)，而其中乳酸菌、大腸桿菌可能是牛糞中的優勢菌群。【結論】試驗前期和后期總細菌、大腸桿菌、金黃色葡萄菌的數量有明顯變化，牛糞中存在多種細菌表現了牛糞中微生物菌群的多樣性。

發酵棉粕；細菌；數量；DGGE；多樣性

0 引 言

【研究意義】蛋白質是維持生命機體所必需的營養物質。畜牧業中常采用谷物、餅粕、草類等原料配制動物日糧來滿足動物對蛋白質的需求[1-2]。目前隨著畜牧業生產的發展，蛋白飼料緊缺問題逐漸凸顯，原有常規飼料亦然不能滿足目前快速發展的需求，所以如何合理開發和利用其它非常規蛋白質飼料，對我國畜牧業的發展起到至關重要的作用。棉籽因其產量高、蛋白含量豐富、代謝能高等，因此開發其副產物不僅可減少資源浪費，且為有效解決我國飼料緊缺問題提供了可能[3-4]。【前人研究進展】棉粕經過發酵后，其表面附著的微生物利用底物大量繁殖，不僅提高了自身菌體蛋白的含量，且有益于家畜的有效利用[5]。然而動物腸道中寄生著種類繁多和數量巨大的微生物。在正常情況下，互相之間以穩定的比例關系與宿主腸道相互依存又相互影響，形成動態的微生態平衡。而飼料源是否發酵可能會影響家畜腸道菌群的穩定性，從而影響家畜的吸收利用水平[6-8]。嗜酸乳酸桿菌能夠調整腸道菌群平衡，其分泌的抗生物素類物質嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素、乳酸菌素，對腸道致病菌產生的拮抗作用，抑制腸道不良微生物的增殖。枯草芽孢桿菌能促進有益厭氧菌生長，并產生乳酸等有機酸類，降低腸道pH值，間接抑制其它致病菌生長。提高免疫球蛋白和抗體水平，增強細胞免疫和體液免疫功能。其合成的α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內的消化酶類一同發揮作用[9]。劉忠元[10]用熱帶假絲酵母發酵玉米秸稈粉，結果發現玉米秸稈粉中的粗纖維含量下降，粗蛋白含量提高，可以提高秸稈的飼用價值。【本研究切入點】嗜酸乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母均可以作為發酵棉粕的微生物制劑，但是三種菌混合發酵的棉粕對于肉牛的作用還需要進一步的研究。而且目前發酵棉粕在肉牛上的應用還比較欠缺，有關發酵棉粕日糧對肉牛腸道微生物影響方面的報道也比較少[11-12]，應該引起足夠重視。腸道正常菌群與腸道免疫系統的形成和功能、腸上皮細胞的生長有密切關系，并可以阻擋病原微生物的入侵[13-14]。據研究報道，糞中微生物與結腸微生物間具有99%的相似性[15]，因此可利用糞樣來反映腸道微生物的菌群情況。傳統微生物群落結構多采取分離鑒定的方法進行研究，而對于復雜體系且不能分離培養的微生物很難進行群落研究。采用PCR和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分子指紋圖譜技術對于難以分離的菌種可以進行快速有效的檢測[16-18]。【擬解決的關鍵問題】對發酵棉粕飼喂肉牛糞樣中的主要細菌含量進行研究，并采用PCR-DGGE技術探討其糞樣中細菌多樣性，以期揭示發酵棉粕飼喂對肉牛腸道微生物菌群數量和多樣性特征規律，為健康的肉牛養殖技術提供相關理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

新疆西部波爾多牧業有限責任公司選取10月齡左右，健康無疾病，初始體重差異不顯著(259.11±35.62) kg的黑安格斯肉牛18頭，隨機分成兩組(每組9頭)，即試驗(Treatment, T)和對照(Control, C)處理。試驗期從2016年10月8至11月18日，共42 d，預飼期10 d，正飼期32 d。T處理添加6 %的發酵棉粕，C處理添加6 %的未發酵棉粕。發酵棉粕和未發酵棉粕購于新疆天康飼料添加劑公司生產的成品。發酵使用的菌種是嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)以及熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)。列出2個處理與精料混合再與基礎日糧制成TMR，混勻后飼喂，每天分別于06:00和18:00飼喂，任其自由采食，自由飲水。牛舍溫度控制與室外氣溫相同(10℃)，自然光照。表1，表2

表1 發酵棉粕營養水平

表2 基礎日糧組成及營養水平

注：1、精料成分為玉米51%、麩皮24%、豆粕18%、尿素1.5%、食鹽1%、碳酸氫鈣2.5%、添加劑2%；2、除代謝能為計算值外其余指標為實測值

Note: 1. Feed ingredients corn 51%, wheat bran 24%, soybean meal 18%, urea 1.5%, salt 1%, calcium hydrogen carbonate 2.5%, additive 2%. In addition to the metabolic energy for the calculation of the remaining indicators for the measured value

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

正飼期的第16 d(試驗前期)和第32 d(試驗后期)，分別在肉牛的直腸取糞樣5 g左右，置于滅菌的螺口管中，每頭肉牛的糞樣采取3份，迅速放入液氮保存，用于細菌DNA的提取和平板計數使用。

1.2.2 細菌平板培養

采用傳統平板計數法進行計數[19]，其中總細菌采用NA培養基，好氧培養，培養溫度37℃；大腸桿菌采用LB培養基，好氧培養，培養溫度37℃；金黃色葡萄球菌采用BP培養基，好氧培養，培養溫度37℃；乳酸菌采用MER培養基，好氧培養，培養溫度37℃。在恒溫箱培養2～3 d的時間，即可進行菌落計數。其中梯度稀釋總細菌和大腸桿菌選擇10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度；其中梯度稀釋金黃色葡萄球菌和乳酸菌選擇10-5、10-6、10-7和10-8四個稀釋梯度。計數結果10為底數的對數表示。

1.2.3 樣品總細菌DNA提取

從滅菌的螺口管中稱取0.5 mL的糞便樣本至2 mL離心管中，并置于冰上。糞樣中細菌總DNA的提取方法按照提取試劑盒(TIANamp Stool DNA Kit)說明進行提取。

1.2.4 細菌16Sr DNA 基因V6-V8區PCR擴增

選用細菌通用引物對細菌的16Sr DNA V6-V8區域進行PCR擴增，擴增體系為50 μL：2 μL模板DNA，2 μL上游引物(U968-GC)，2 μL下游引物(L1401)，PCR Mix預混液 25 μL，dd H2O 19 μL。引物序列為，U968-GC：5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’；L1401：5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’。擴增程序：95℃預變性10 min，(95℃變性45 s，56℃褪火45 s，72℃延伸45 s)33個循環，最終72℃延伸10 min。PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后于-20℃保存。

1.2.5 變性梯度凝膠電泳

DGGE采用Dcode突變檢測系統(Bio-Rad)及雙梯度法進行。聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=37.5∶1質量比)，變性梯度為40%～60%，其中40%濃度的膠(低濃度)為100%儲存液4.4 mL+0%儲存液6.6 mL，60%濃度的膠(高濃度)為100%儲存液6.6 mL+0%儲存液4.4 mL，最后將兩種濃度的膠加入專用注射器緩緩注入電泳玻璃板中間，然后快速注入濃縮膠(0%儲存液6 mL+20%過硫酸銨60 μL+四甲基乙二胺6 μL)，插入梳子，待膠半干時緩緩拔下梳子，點入PCR產物，放置與電泳槽中(50×TAE緩沖液，預熱至60℃)200 V電壓預10 min，然后85 V電壓跑14 h。最后用溴化乙錠(EB)進行染色30 min、dd H2O脫色3次，脫色完畢后采用凝膠成像儀進行成像拍照保存，用于后期分析。

1.2.6 回收條帶及測序

在紫外燈下用無菌刀片從膠上切下有差異和無差異的條帶，將切下的條帶放入對應編號的滅菌的1.5 mL離心管中，用去離子水漂洗兩次后加入20 μL TE溶液，4 ℃過夜。將回收的DNA用不帶GC夾子的U968/L1401擴增，擴增條件同上。擴增產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后成像，切下明亮條帶進行回收、純化(采用PCR回收純化試劑盒)。連接T載體(采用T-載體PCR產物克隆試劑盒)后送至北京六合華大基因公司進行測序。測得的16S rDNA序列經過Genbank數據庫進行比對。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2013軟件進行整理，利用SPSS17.0軟件對分析結果進行統計分析，通過獨立樣本t檢驗方法進行顯著性檢驗，試驗結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵棉粕飼料對肉牛牛糞中細菌數量的影響

試驗前期，C組和T組總細菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組大腸桿菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組金黃色葡萄球菌差異不顯著(P>0.05)；C組和T組乳酸菌差異顯著(P<0.05)。試驗后期，C組和T組總細菌差異不顯著(P>0.05)；C和T組大腸桿菌差異顯著(P<0.05)；C和T組金黃色葡萄球菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組乳酸菌差異顯著(P<0.05)。總細菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌數量的變化體現了牛糞中微生物菌群數量上的多樣性。

表3 不同時期發酵棉粕飼料下肉牛牛糞中細菌數量變化

注：表中T為試驗組和C為對照組

Note: T in the table is the treatment group and C as the control group

2.2 細菌16S rDNA 基因V6-V8區PCR擴增

試驗提取的總DNA，經過1%的瓊脂凝膠電泳檢測，基因組DNA長度在23 kp左右。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，各泳道均得到清晰明亮、長度在500 bp且無非特異性擴增的條帶，陰性對照無條帶，符合目的基因片段，可用于后續的DGGE電泳。圖1(a)

2.3 DGGE多樣性

2.3.1 變性梯度凝膠電泳結果

通過DDGE技術從各個時期的樣品中分離出來了不同數目的條帶。4個泳道中不同條帶數目，可以直接說明糞樣中微生物菌群的多樣性。DGGE圖譜中每一個泳道代表一個樣品，泳道中的每一個條帶都有其自身的遷移速度和對應的光強。不同的遷移速度代表不同的細菌種類，條帶的亮度代表著細菌種類的數量，亮度越高說明此種細菌的數量眾多，可以鑒別出此樣品中微生物菌群的優勢菌。除了存在不同的條帶還存在相同的條帶，表明其屬于同一種細菌，其明暗程度也表明了細菌的數量差異。圖1(b)

2.3.2 DGGE指紋圖譜

通過Quantity One軟件對DGGE指紋圖譜進行分析。不同泳道的聚類分析顯示，不同泳道可分為3類，其中CB為一類，CA分為一類，TB和TA分為一類。不同泳道的相似性分析如圖1(d)所示。其中相似性最小(56.4)的為CB和CA。相似性最大(72.0)的TB和TA。CB和TB的相似性為58.7。TB和CA的相似性為62.3。CB和TA的相似性為59.8。CA和TA的相似性為60.5。圖1(c)

注：圖中CB(Control Before)為對照組前期；TB(Treatment Before)為試驗組前期；CA(Control After)為對照組后期；TA(Treatment After)為試驗組后期

Note: the figure in CB (Control Before) as the control group in early; TB (Treatment Before) as the experimental group early; CA (Control After) as the control group later; TA (Treatment After) as the experimental group later

圖1 16S rDNA 基因V6-V8區PCR擴增、DGGE指紋圖譜、聚類分析及相似性矩陣

Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA gene in V6-V8 region, DGGE fingerprinting, cluster analysis and similarity matrix

2.3.3 回收條帶測序及序列

DGGE圖譜主要條帶的測序結果表明，從不同組別和時期的細菌DGGE圖譜上共標記了11條特異性條帶，將檢測出的每一個條帶序列和NCBI數據庫進行序列比對，得到同源性最高的菌株，分別是：1為Salmonellaentericasp.，2為Ruminococcussp.，3為Lactobacillussp.，4為Lactobacillussp.，5為Lachnospiraceaesp.，6為Shigellasp.，7為Clostirdiumsp.，8為Escherichiacolisp.，9為Escherichiacolisp.，10為Enterobactersp.，11為Enterococcussp.，且同源性均超過了96%。

試驗DGGE圖譜主要條帶切膠測序，糞中細菌種類較為豐富。CB中條帶最亮的為4、9、11，表明乳酸菌、大腸桿菌、腸球菌可能是其優勢菌群；TB中條帶最亮的為4、5、8、9，表明乳酸菌、大腸桿菌可能是其優勢菌群；CA中條帶最亮的為3、8、9，表明乳酸菌、大腸桿菌可能是其優勢菌群；TA中條帶最亮的為3、8、9，表明乳酸菌、大腸桿菌可能是其優勢菌群。CB、TB、CA、TA四組中有兩個相同菌屬，包括2個乳酸菌和2個大腸桿菌。表4

表4 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列比對

3 討 論

3.1 牛糞中細菌數量差異性的影響

牛糞中菌群的數量采用傳統的平板計數方法。此方法雖然利用不同類型的培養基經過適時的培養即可得到相應的菌落數量，實行起來簡單，但是在后期進行菌落計數的時候，由于肉眼無法清除的識別每個菌落的數量，可能造成菌落計數結果偏低[20-22]。

試驗前期和試驗后期上，金黃色葡萄球菌含量均成降低的趨勢，金黃色葡萄球菌在健康動物的機體內正常繁殖具有其一定的作用，但如果失去平衡的話，將會引起動物機體的紊亂嚴重的話會導致動物生病，例如金黃色葡萄球菌可以產生腸毒素，腸毒素是一種耐熱的外毒素，也不受胰蛋白酶的影響，可引起急性胃腸炎。但是乳酸菌的含量在試驗前期和試驗后期是成上升趨勢的，乳酸菌在動物體內能發揮許多的生理功能。大量研究資料表明，乳酸菌能促進動物生長，調節胃腸道正常菌群、維持微生態平衡，從而改善胃腸道功能；提高食物消化率和生物效價；降低血清膽固醇，控制內毒素；抑制腸道內腐敗菌生長；提高機體免疫力等[23]。試驗結果表明，在安格斯肉牛上飼喂發酵棉粕，在一定程度上改變了其腸道微生物細菌數量的變化，可能減少某些致病細菌的數量，增加有益菌的數量。

反芻動物的腸道中寄居著大量的微生物，微生物菌群的數量及整個微生物區系的組成受多種生理因素、飼料組成和環境因素等影響[24]。糞樣中的微生物與結腸中的微生物有99%的相似性，因此想了解反芻動物腸道微生物的數量及多樣性可以通過糞中的微生物反推腸道微生物的數量及多樣性。飼喂同種飼料且相同品種的牛，其糞中微生物區系不完全相同，由于動物自身生理上存在個體差異，故在試驗結果中，不能排除個體差異對不同細菌數量造成的影響。

3.2 牛糞中細菌多樣性的影響

不同提取DNA的方法會直接影響細菌多樣性的結果，因此提取純度高，雜帶少的DNA是進行變性凝膠電泳成功的首要條件。試驗采用TIANamp Stool DNA Kit，該試劑盒操作方法簡單、提取所需時間短且去除抑制物、雜質蛋白及細胞中其他有機化合物的效果很好，被廣泛應用于動物糞便DNA的提取。此方法可獲得純度高，質量穩定的DNA片段，可滿足后續變性凝膠電泳的試驗。

微生物相似性及多樣性在DGGE指紋圖譜中體現為條帶的有無及條帶亮度的變化。由于DGGE技術只能分辨數量占超過總細菌1 %的細菌種類[25]，所以指紋圖譜中的條帶一定程度上應理解為優勢細菌，某一條帶的缺失并不一定是其不存在，而可能是數量上處于劣勢，在圖譜中不能得以體現。PCR-DGGE是一種快速可靠的比較細菌群落的方法，DGGE條帶再經切膠和測序，有助于人們了解微生物多樣性。試驗結果中沒有測序得出嗜酸乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌等菌的序列，其原因可能是由于在切膠回收條帶的環節人為誤差造成的，故在試驗結果中，不能排除個人操作技術的影響。

對DGGE指紋圖譜進行分析，不同泳道的聚類分析劃分為3類，其中CB、CA各為一類，TB和TA歸為一類。說明飼喂未發酵棉粕的消化道菌群中細菌的數量以及分布上存在較大差別。結合微生物技術的結果來看，試驗前期和試驗后期上C組總細菌和乳酸菌數量都有減少的趨勢，大腸桿菌數量有增加的趨勢，金黃色葡萄球菌數量變化不大；試驗前期和試驗后期上T組總細菌和乳酸菌數量變化不明顯，大腸桿菌數量有增加的趨勢，金黃色葡萄球菌數量有減少的趨勢。CB、CA各為一類，很可能是因為C組總細菌數量和其中各種菌的數量在試驗前期和后期有不同變化的原因造成的。

微生物菌群非常依賴日糧分解產物作為最終代謝底物，不同種類細菌所需底物和生長條件不同[26]。聶存喜等[27]研究用不同微生物發酵的多種小分子代謝產物含量會因菌種而異。棉粕使用嗜酸乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌以及熱帶假絲酵母菌三種復合菌種發酵，可能改變其產生的代謝產物的含量，而且不同細菌生長所需的營養物質也不同，因此改變了腸道細菌多樣性，具體的影響機制還需進一步深入研究。

4 結 論

4.1 飼喂發酵棉粕，牛糞中細菌的數量有所改變。試驗前期，添加發酵棉粕顯著降低總細菌和大腸桿菌數量，提高乳酸菌數量。試驗后期，添加發酵棉粕顯著降低大腸桿菌、金黃色葡萄球菌數量，顯著提高乳酸菌數量。

4.2 飼喂發酵棉粕，通過測序檢測到牛糞含有大量的微生物，測序得到11種細菌，分別所屬瘤胃球菌、乳酸菌、大腸桿菌、梭菌等8個菌屬。

4.3 飼喂未發酵棉粕組初期與末期(CB與CA)前后DGGE指紋圖譜聚類分析劃分為2類，而飼喂發酵棉粕初期與末期(TB與TA)前后DGGE指紋圖譜聚類分析劃分為1類。

References)

[1] 何濤. 棉籽粕的發酵脫毒及其在肉仔雞中的應用研究[D]. 北京：中國農業科學院碩士學位論文, 2008.

HE Tao. (2008).StudiesonBio-detoxificationofCottonseedMealandItsApplicationinBroilerDiets[D]. Master Dissertation.Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. (in Chinese)

[2]郭書賢, 王冬梅, 梁運祥. 微生物發酵棉籽餅粕脫毒與利用研究進展[J]. 中國釀造, 2009, 28(1): 4-10.

GUO Shu-xian, WANG Dong-mei, LIANG Yun-xiang. (2009). Research progress on microbial detoxification and utilization of cottonseed cake [J].ChinaBrewing, 28(1):4-10. (in Chinese)

[3]Zhang, W. J., Xu, S. H., Sun, J. Y., & Xia, Y. (2007). Development of a microbial fermentation process for detoxification of gossypol in cottonseed meal.AnimalFeedScience&Technology, 135(2): 176-186.

[4]ZHANG, Wen-ju, Zi-rong, Jian-yi, & YANG. (2006). Effect of selected fungi on the reduction of gossypol levels and nutritional value during solid substrate fermentation of cottonseed meal.JournalofZhejiangUniversity-ScienceB(Biomedicine&Biotechnology) , 7(9): 690-669.

[5]邱良偉. 發酵對棉粕營養特性及其在肉雞中的應用研究[D]. 合肥:安徽農業大學碩士學位論文, 2012.

QIU Liang-wei. (2012).Effectofdifferentfermentationprocessonthenutritionalcharacteristicsofcottonseedmeal[D]. Master Dissertation. Anhui Agricultural University, Hefei. (in Chinese)

[6]張國民, 張國棟. 用發酵棉粕代替豆粕飼喂犢牛效果試驗[J]. 新疆畜牧業, 2004,(2): 18-20.

ZHANG Guo-min, ZHANG Guo-dong. (2004).Using fermented cottonseed meal instead of soybean meal fed calves effect test [J].XinjiangAnimalHusbandry, (2):18-20. (in Chinese)

[7]閆理東, 張文舉, 聶存喜, 等. 發酵棉粕對黃羽肉雞生產性能和屠宰性能的影響[J]. 石河子大學學報(自然科學版), 2012, 30(2): 171-176.

YAN Li-dong, ZHANG Wen-ju, NIE Cun-xi, et al. (2012). Effect of Fermented Cottonseed Meal on Growth Performance and Slaughter Performance in Yellow-Feathered Broilers [J].JournalofShiheziUniversity(NaturalScience) , 30(2):171-176. (in Chinese)

[8]湯江武, 吳逸飛, 孫宏, 等. 發酵棉粕對肉雞生長性能、血清生化指標及免疫功能的影響[J]. 中國畜牧雜志, 2011, 47(5): 29-34.

TANG Jiang-wu, WU Yi-fei, SUN Hong, et al. (2011). Effects of Fermented Cottonseed Meal on Growth Performance, Serum Biochemical Parameters and Immunity of Broilers [J].ChineseJournalofAnimalScience, 47(5):29-34. (in Chinese)

[9]高學文,姚仕義,Huong Pham, 等. 基因工程菌枯草芽孢桿菌GEB3產生的脂肽類抗生素及其生物活性研究[J]. 中國農業科學,2003,(12):1 496-1 501.

GAO Xue-wen, YAO Shi-yi, Huong Pham, et al. (2003). Lipopeptide Antibiotics Produced by the Engineered StrainBacillussubtilisGEB3 and Detection of Its Bioactivity [J].ScientiaAgriculturalSinica, (12):1,496-1,501. (in Chinese)

[10]劉忠元. 熱帶假絲酵母和黑曲霉發酵玉米秸稈的條件優化[D]. 長春: 吉林大學碩士學位論文, 2007.

LIU Zhong-yuan. (2007).OptimizingtheFermentationConditionofMaizeStoverbyCandidatropicalisandAspergillusniger[D]. Master Dissertation. Jilin University, Changchun. (in Chinese)

[11]秦金勝, 禚梅, 許衡, 等. 發酵棉粕和普通棉粕替代豆粕對豬生長性能的影響[J]. 新疆農業大學學報, 2010, 33(6): 496-501.

QIN Jin-sheng, ZHUO Mei, XU Heng, et al. (2010). Effect of Common Cottonseed Meal and Fermented Cottonseed Meal Substituted for Soybean Meal on the Growth Performance of Pigs [J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity, 33(6):196-501. (in Chinese)

[12]丁超,和玉丹,鄭云林.發酵棉粕替代豆粕對生長豬生長性能的影響[J].飼料工業,2010,31(24): 47-48.

DING Chao, HE Yu-dan, ZHENG Yun-lin. (2010). Effect of Fermented Cottonseed Meal Substituted for Soybean Meal on the Growth Performance of Pigs [J].FeedIndustry, 31(24): 47-48.(in Chinese)

[13] Lamont, R. F., Sobel, J. D., Akins, R. A., Hassan, S. S., Chaiworapongsa, T., & Kusanovic, J. P., et al. (2011). The vaginal microbiome: new information about genital tract flora using molecular based techniques.BjoganInternationalJournalofObstetrics&Gynaecology, 118(5): 533.

[14] Wang, Y., Ametaj, B. N., Ambrose, D. J., & G?nzle, M. G. (2013). Characterisation of the bacterial microbiota of the vagina of dairy cows and isolation of pediocin-producing pediococcus acidilactici.BMCMicrobiology, 13(1): 1-11.

[15]圖雅. 虎糞細菌區系16S rDNA動態[D]. 南京:南京農業大學博士學位論文,2002.

TU Ya. (2002).DynamicofBacterial16SrDNAofTiger'sFecalFlora[D]. PhD Dissertation. Nanjing Agricultural University, Nanjing. (in Chinese)

[16]潘康成,陳正禮,崔恒敏,等.利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技術分析喂服枯草芽孢桿菌肉雞腸道菌群的多樣性[J].動物營養學報,2010,22(4): 985-991.

PAN Kang-cheng, CHEN Zheng-li, CUI Heng-min, et al. (2010). Analysis of Intestinal Microflora Diversity in Broilers Treated with Bacillus subtilis by ERIC-PCR and PCR-DGGE [J].ChineseJournalofAnimalNutrition, 22(4): 985-991. (in Chinese)

[17]吳利, 余育和, 馮偉松. PCR-DGGE技術在環境微型生物群落研究中的應用 [J]. 合肥師范學院學報, 2010, 28(6): 103-108.

WU Li, YU Yu-he, FENG Wei-song. (2010). Application of PCR-DGGE in Study of Microbial Community [J].JournalofHefeiNormalUniversity, 28(6):103-108. (in Chinese)

[18]Zoetendal, E. G,. Akkermans, A. D. L, Vos W. M. D. (1998).Temperature Gradient Gel Electrophoresis Analysis of 16S rRNA from Human Fecal Samples Reveals Stable and Host-Specific Communities of Active Bacteria.Applied&EnvironmentalMicrobiology, 4(10): 3,854-3,859.

[19]陳天壽. 微生物培養基的制造與應用[M]. 中國農業出版社, 1995.

CHEN Tian-shou. (1995).ManufactureandApplicationofMicrobialCultureMedium[M]. Beijing: China Agriculture Press. (in Chinese)

[20]Amann, R. I., Ludwing, W., Schleifer, K. H. (1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.MicrobiologicalReviews, 59(1): 143-169.

[21]Allen, M. J., Edberg, S. C., & Reasoner, D. J. (2004). Heterotrophic plate count bacteria--what is their significance in drinking water.InternationalJournalofFoodMicrobiology, 92(3): 265-274.

[22]Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., & Barer, M. R. (1998). Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues.AntonievanLeeuwenhoek,73(2): 169-187.

[23]趙紅霞, 詹勇, 許梓榮. 乳酸菌的研究及其應用[J]. 江西飼料, 2003,(1): 9-12.

ZHAO Hong-xia, ZHAN Yong, XU Zi-rong. (2003).Research and application of lactic acid bacteria [J].JiangxiFeed, (1):9-12. (in Chinese)

[24]張心壯, 孟慶翔, 崔振亮,等. 利用PCR-DGGE技術研究不同代乳料對奶公犢糞樣細菌區系的影響[J]. 中國畜牧雜志, 2013, 49(5): 27-30.

ZHANG Xin-zhuang, MENG Qing-xiang, CUI Zhen-liang, et al. (2013).Study on different effects of milk replacer on calf fecal bacterial flora by the technology of PCR-DGGE [J].ChineseJournalofAnimalScience, 49(5):27-30. (in Chinese)

[25]吳高鋒, 李文剛, 高衛科, 等. PCR-DGGE的原理及在動物腸道菌群分析中的應用[J]. 中國畜牧獸醫, 2008, 35(6): 37-39.

WU Gao-feng, LI Wen-gang, GAO Wei-ke, et al. (2008). The principle of PCR-DGGE and its application in the analysis of intestinal flora in animals [J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 35(6):37-39. (in Chinese)

[26]胡平. 不同形態玉米日糧及日齡對鵝腸道微生物區系的影響[D]. 揚州:揚州大學碩士學位論文, 2010.

HU Ping. (2010).EffectsofCornFeedFormsandAgeonIntestinalMicrofloraofGeese[D]. Master Dissertation. Yangzhou University, Yanzhou. (in Chinese)

[27]聶存喜, 張文舉, 閆理東,等.棉籽粕源發酵蛋白質飼料的代謝產物研究[J]. 動物營養學報, 2012, 24(8): 1 602-1 609.

NIE Cun-xi, ZHANG Wen-ju, YAN Li-dong, et al. (2012). A Study of Metabolites of Protein Feed Fermented with Cottonseed Meal Mixed Substrates [J].ChineseJournalofAnimalNutrition, 24(8):1,602-1,609. (in Chinese)

Study of Bacterial Number and Diversity in Manure of Beef Cattle Fed by Fermented Cottonseed Meal

LIANG Min1, ZHANG Wen-ju1, ZHANG Fan-fan1, CHEN Ning1, YIN Jun-liang2

(1. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003, China; 2. Research Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi Xinjiang 832000, China)

【Objective】 To study the effect of feeding fermented cottonseed meal on the number of bacteria and diversity in Angus beef cattle manure.【Method】The number of bacteria was calculated by plate counting method, V6-V8 DNA gene amplification of bacterial 16S rDNA was performed by PCR technique. The PCR products were subjected to denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The specific bands of fingerprint were obtained and sequenced, and bacterial strains were identified by BLAST.【Result】(1) In early experiment, there were significant differences in total bacteria,EscherichiacoliandLactobacillusbetween group C and group T (P< 0.05), but no significant difference inStaphylococcusaureusbetween them (P> 0.05). In late experiment, there was no significant difference in total bacteria between group C and group T (P> 0.05), butEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandLactobacilluswere significantly different (P< 0.05). (2) Bacteria found in cow dung were:Salmonella,Ruminococcus,Lactobacillus,Lachnospiraceae,Shigella,Clostridium,Escherichiacoli,EnterobacterandEnterococcus, and among them,LactobacillusandEscherichiacolimight be the dominant bacteria in cow manure. 【Conclusion】Total bacteria,EscherichiacoliandStaphylococcusaureushave obvious change in the number of early and late experiment period. There are many kinds of bacteria in cow dung, which reflect the diversity of microbial flora in cow manure.

fermented cottonseed meal; bacteria; number; DGGE; diversity

ZHANG Wen-ju (1966- ), male, native place: Shanxi. Professor, research field: The development and utilization of feed resources. (E-mail) zhangwj1022@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.07.019

2017-04-12

新疆兵團重大科技項目(2014AA001)

梁敏(1992- )，女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向為飼料資源的開發與利用，(E-mail)10214969502@qq.com

張文舉(1966- )，男，陜西臨潼人，教授，博士生導師，研究方向為飼料資源的開發與利用，(E-mail)zhangwj1022@sina.com

S816

A

1001-4330(2017)07-1323-09

Supported by: Major Science and Technology R&D Program of XPCC (2014AA001)