羊鏈球菌病滅活疫苗生產工藝研究

禮 穎，秦立鑫

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

羊鏈球菌病滅活疫苗生產工藝研究

禮 穎，秦立鑫

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

目前羊鏈球菌病作為羊場發病的一種新型病引起廣泛關注，因此該病疫苗的制備受到生物制品企業的重視。文章對羊鏈球菌病滅活疫苗的生產工藝進行研究。

羊鏈球菌病；生產工藝；滅活疫苗

羊鏈球菌病是嚴重危害山羊、綿羊的疫病，是由溶血性鏈球菌引起的一種急性熱性傳染病。此病主要通過消化道和吸呼道傳染，鏈球菌最易侵害的是綿羊，山羊也很容易感染，多在羊只體況比較弱的冬春季節呈現地方性流行[1-7]。目前羊鏈球菌病作為羊場發病的一種新型病引起廣泛關注，因此該病疫苗的制備受到生物制品企業的重視，本文對羊鏈球菌病滅活疫苗的生產工藝進行研究。

1 試驗材料與動物

生產用種子制造和檢驗本品用的菌種為羊鏈球菌C55001和C55002菌株，由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應。“岳1系”或“St.0.6”菌株，分別暫由新疆生物藥品廠和四川生物藥品廠鑒定、保管和供應。培養基包括緩沖肉湯瓊脂、緩沖肉湯、40%葡萄糖溶液、酪胨瓊脂斜面（G.A）、硫乙醇酸鹽酪胨湯（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P）。試驗動物為大耳白家兔、綿羊，由動物實驗室提供。

2 菌種制備

2.1 基礎種子

羊鏈球菌C55001和C55002菌株凍干菌種用滅菌2～5 mL pH 7.6緩沖肉湯分別進行溶解，接種未經免疫的綿羊，3～5 d采取發病而死的綿羊心血，制備基礎菌種，-15℃保存1年。

2.2 生產用種子制備

一級種子繁殖及鑒定：取低溫保存的2～3株死羊血菌種，分別接種于血液瓊脂大管斜面上，37℃培養16～20 h，取樣接種血液瓊脂斜面和厭氣肉干湯，純粹檢驗合格后，作為一級種子。在2～8℃保存，每周移植1次，使用期≤1個月。在培養基上繼代，不超過4代。

二級種子繁殖：用緩沖肉湯分別洗下各株一級種子，混合接種于緩沖肉湯中，37℃培養16～20 h，經純檢合格后，置2～8℃保存≤4 d。

2.3 制苗用菌液制備

2.3.1 菌液培養

將緩沖肉湯置37℃預熱24 h后，按培養基量的0.2%加入葡萄糖（制成50%溶液），也可同時按總量的1%～2%加入血清或血紅素，并按總量的5%接入二級種子液，37℃培養18～24 h，培養期間搖瓶3次。

2.3.2 純粹檢驗

從大瓶菌液中取樣，接種于血液瓊脂斜面、馬丁肉湯和厭氣肉干湯，37℃培養24 h后進行檢查，并經鏡檢純粹后方可配苗。

2.3.3 活菌計數

用含10%綿羊脫纖血（或血清）瓊脂平板進行計數。

2.3.4 滅活

按菌液總量的0.3%加入甲醛溶液，充分振蕩后，置37℃滅活16～24 h，期間搖瓶2～3次。

2.3.5 滅活檢驗

將菌液接種于血液瓊脂斜面，37℃培養48 h，應無菌生長。

2.3.6 無菌檢驗

將待測樣品接種TG小瓶（50 mL·瓶-1），接種量為1.0 mL·瓶-1，置37℃培養，3 d后吸取培養物，分別接種GA斜面、TG小管各2支和GP小管1支，接種量為0.2 mL·支-1，一支GA斜面和TG小管置37℃培養，一支GA斜面、TG小管和GP小管置25℃培養，均培養5 d，每日觀察結果并記錄。

2.4 配苗

檢驗合格后，按菌液5份加滅菌氫氧化鋁膠1份進行配苗。經充分振蕩后于冷暗處保存，制備成6個批次產品。

2.5 安全檢驗

用體重1.5～2.0 kg家兔2只，各皮下注射疫苗3.0 mL，觀察10 d。

2.6 效力檢驗

用1～3歲健康易感綿羊4只，各皮下注射疫苗5.0 mL，21日后連同條件相同的對照羊3只，各靜脈注射致死量羊鏈球菌強毒，觀察21～30日，對照羊全部死亡，免疫羊至少保護3只；或對照羊死亡2只，免疫羊全保護為合格。

3 試驗結果

各批次培養時間及培養菌數對比見表1，滅活檢驗情況見表2，無菌檢驗結果見表3，安檢情況見表4，效力檢驗情況見表5。

表1 各批次培養時間及培養菌數對比表

表2 滅活檢驗情況

通過表1各批次培養時間與菌數情況，可知18～26 h期間菌數為逐漸遞增，到達28 h時，開始有大量菌體死亡，進入衰亡期。由表2與表3可見，各批次相應的滅活檢驗及無菌檢驗均達到要求，為安全檢驗與效力檢驗做好保障。由表4可知，各批次安全檢驗均達到要求。由表5可知，201501、201502、201505、201506效力均未達到要求，為不合格，201503與201504效力達到要求。

表3 無菌檢驗結果

表4 安檢情況

表5 效力檢驗情況

4 結 論

201505批培養時間為26h，培養菌數28億個·mL-1，效力檢測中未能達標；201503批培養時間為22h，培養菌數18億個·mL-1，但其效力檢測結果達到標準線；201504批培養時間為24h，培養菌數為22億個·mL-1，其效力檢測結果良好。說明在培養時間范圍之內，菌數達到約20億個·mL-1免疫效果最好。

[1] 王保仙.羊鏈球菌病的診斷與預防措施[J].當代畜牧,2015（3）:56-57.

[2] 才木德,娜爾力瑪.羊鏈球菌病的診斷[J].畜牧與飼料科學,2001,22（3）:42.

[3] 單細法,馮利華.羊鏈球菌病的診斷與防治[J].當代畜牧,2015（35）:83-84.

[4] 趙萬軍,胡鵬,蒲新竹,等.綿羊鏈球菌病的診斷與防治[J].甘肅畜牧獸醫,2015,45（6）:50.

[5] 韓濤,陳世軍,沈辰峰,等.羊鏈球菌病的診治[J].現代農業科技,2015（20）:238-239.

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[7] 欒海濤.羊鏈球菌病的診斷與防治措施[J].養殖技術顧問,2013（5）:101.

Study on the Production Technology of Inactivated Vaccine Against Sheep Streptococcus Disease

LI Ying,QIN Lixin
（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

At present,the sheep streptococcal disease as a new disease caused widespread concern,so the dis?ease vaccine was prepared by biological products enterprises.This paper researched on the production process of sheep streptococcal disease inactivated vaccine.

sheep streptococcus disease;production process;inactivated vaccine

S826；S852.61+1

A

1001-0084（2017）08-0043-04

2017-06-22

禮穎（1974-），女，遼寧遼中人，獸醫師，主要從事疫苗生產的研究與應用。