SPME—GC—NPD法測定肉制品中揮發性N—亞硝胺的條件優化

張甜+樊曉盼+熊鳳嬌+王娜+楊華+馬儷珍

摘 要：利用固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）結合氣相色譜-氮磷檢測器（gas chromatography-nitrogen-phosphorus detector，GC-NPD）測定肉制品中9 種揮發性N-亞硝胺。通過優化平衡時間、解析時間、萃取時間、萃取溫度、NaCl濃度和轉速確定9 種揮發性N-亞硝胺的最佳萃取條件。結果表明：以PDMS/DVB/CAR為萃取頭，平衡時間10 min、萃取溫度40 ℃、萃取時間30 min、攪拌速率400 r/min、NaCl質量濃度0.36 g/mL、解吸時間3 min時能得到最佳萃取效果。采用SPME結合GC-NPD測定9 種N-亞硝胺的線性相關系數為0.994 9～0.999 7，檢出限為0.01～10.00 ng/mL，定量限為0.03～33.00 ng/mL，回收率為50.19%～93.20%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.29%～9.65%。該方法可以滿足肉制品中N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）和N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）這4 種物質含量的測定。

關鍵詞：固相微萃取；肉制品；N-亞硝胺；萃取條件

Optimization of Extraction Conditions for the Determination of Volatile N-Nitrosamines in Meat Products Using Solid-Phase Microextraction Combined with Gas Chromatography with Nitrogen-Phosphorus Detection

ZHANG Tian1， FAN Xiaopan2， XIONG Fengjiao2， WANG Na2，*， YANG Hua2， MA Lizhen2

（1.College of Food Science and Engineering， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， China；

2.College of Food Science and Biotechnology， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： Nine volatile N-nitrosamines in meat products were extracted by solid-phase microextraction （SPME） and determined by gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection （GC-NPD）. The optimum extraction conditions were established as follows： using PDMS/DVB/CAR fiber， equilibrium time 10 min， extraction time 30 min， extraction temperature 40 ℃， stirring speed 400 r/min， concentration of NaCl 0.36 g/mL， and desorption time 3 min. The linear correlation coefficients for the nine analytes were 0.994 9?0.999 7. The limits of detection were 0.01?10.00 ng/mL，

and the limits of quantification were 0.03?33.00 ng/mL. The recoveries of the presented method were in the range of 50.19%?93.20%， with relative standard deviation （RSD） of 2.29%?9.65%. In conclusion， the method could be used for the determination of N-nitrosodimethylamine （NDMA）， N-nitrosodiethylamine （NDEA）， N-nitrosodipropylamine （NDPA）， and N-nitrosodibutylamine （NDBA） in meat products.

Key words： solid-phase microextraction； meat product； N-nitrosamines； extraction conditions

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707009

中圖分類號：TS251.6 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）07-0050-07

引文格式：

張甜， 樊曉盼， 熊鳳嬌， 等. SPME-GC-NPD法測定肉制品中揮發性N-亞硝胺的條件優化[J]. 肉類研究， 2017， 31（7）：

50-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707009. http：//www.rlyj.pubendprint

ZHANG Tian， FAN Xiaopan， XIONG Fengjiao， et al. Optimization of extraction conditions for the determination of volatile N-nitrosamines in meat products using solid-phase microextraction combined with gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection[J]. Meat Research， 2017， 31（7）： 50-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707009. http：//www.rlyj.pub

N-亞硝胺是一種N-亞硝基化合物，其化學通式為R1R2N—N=O。它是由二級胺與亞硝化劑反應生成的，例如作為肉制品加工中的亞硝化劑，亞硝酸鹽或硝酸鹽與其降解產生的二級胺反應就會形成N-亞硝胺[1]。許多動物實驗已經證明大部分N-亞硝胺有致癌、致畸和致突變性[2-3]。在日常飲食中，它會在食品的前處理、加工和保存過程中產生[4]。N-亞硝胺不僅可以在外界環境中形成，還可以直接在人體內形成，尤其是在人的胃里[5]。

肉制品的組成成分十分復雜，且待測組分含量很低，因此在分析檢測N-亞硝胺前對樣品中的N-亞硝胺進行提取和富集至關重要[5]。美國環境保護局規定在殘留物分析中要減少或代替有機溶劑的使用，特別是含有鹵族元素的有機溶劑[6]。目前提取N-亞硝胺的方法，如水蒸氣蒸餾[7-8]、低溫真空蒸餾[9]、溶劑液-液萃取[4]和固相萃取[10]等，仍然需要大量的有機溶劑，超臨界流體萃取[11]和固相微萃取[12]不需要用到有機溶劑，但是超臨界流體萃取設備成本高，提取過程復雜，被提取物的損失率高。N-亞硝胺最普遍的分析方法是氣相色譜（gas chromatography，GC）法[13-16]和液相色譜法[17-20]，也有采用膠束毛細管電動色譜法[21-22]進行測定的，而由于氣相色譜法能夠提供良好的分辨率，且很容易耦合具有敏感性和選擇性的檢測器往往會被作為首選[23-24]。

氮磷檢測器（nitrogen-phosphorus detector，NPD）是對氮、磷化合物有選擇地進行高靈敏度檢測的檢測器，可用于藥品的代謝分析、聚脲系及磷系農藥的殘留分析、亞硝基胺、三甲胺、樹脂中的丙烯脯等氮、磷化合物的選擇微量分析。盧紅兵等[25]利用NPD結合GC對煙草中特有的N-亞硝胺進行了測定和分析，楊華等[26]用NPD結合GC測定了肉制品中的3 種揮發性N-亞硝胺。

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）是一種相對較新的樣品前處理技術，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體[27]，且無需溶劑，已在食品分析領域得到了廣泛的應用。SPME比溶劑萃取法更快速、簡單，容易操作，且不需要有毒、昂貴的有機溶劑。Andrade等[12]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-熱能分析儀（head space-solid-phase microextraction-gas chromatography-thermal analyzer，HS-SPME-GC-TEA），以發酵香腸為基質，對SPME條件進行了優化，結果表明，萃取條件對萃取效果的影響很明顯；張秋菊等[28]在用HS-SPME-GC-MS法測定7 種亞硝胺類化合物中的研究也發現萃取條件對實驗結果影響很大；楊華等[26]采用SPME結合氣相色譜儀測定了肉制品中的3 種N-亞硝胺，結果表明，萃取頭的選擇和萃取條件對實驗結果有較大影響。

為了建立快速、有效測定肉制品中N-亞硝胺的方法，本研究用SPME-GC-NPD法測定肉制品中的N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-甲乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidin，NPIP）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-二苯基亞硝胺（N-nitrosodiphenylamine，NDpheA）9 種化合物。對平衡時間、解析時間、萃取溫度、萃取時間、轉速、鹽離子濃度等萃取條件以及檢測條件進行優化，得到最優條件，并對肉制品中的N-亞硝胺含量進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉類油炸制品16 種，均購自當地超市。

N-亞硝胺混合標準品（含有NDMA、NDEA、NMEA、NDBA、NDPA、NPIP、NPYR、NMOR和NDPheA，質量濃度均為2 mg/mL） 美國Sigma公司；甲醇（色譜純）、氯化鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀（配備NPD）、HP-INNOWax毛細管色譜柱 美國Agilent公司；PC-420D固微相萃取儀 墨西哥Corning公司；50/30 μm灰色PDMS/DVB/CAR萃取頭、1 cm磁力攪拌子、15 mL棕色樣品瓶 美國Supelco公司；HH數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件

進樣口溫度：250 ℃，氮磷檢測器溫度：330 ℃，載氣（N2）流速10 mL/min，空氣流速60 mL/min，H2流速3 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持4 min；以10 ℃/min的速率上升至180 ℃，保持2 min；以20 ℃/min的速率上升至220 ℃，保持6 min，運行溫度250 ℃，3 min。endprint

在上述條件下，分析不同流速（2、4、6 mL/min）對9 種N-亞硝胺分離效果的影響。利用安捷倫工作站對色譜圖進行分析及數據處理，用保留時間定性，外標法定量。

1.3.2 樣品前處理

取1 mL液體樣品于15 mL樣品瓶中，加入9 mL飽和NaCl溶液；固體樣品粉碎后取1 g于樣品瓶中，加入9 mL飽和NaCl溶液，攪拌均勻、密封后放入恒溫水浴鍋，平衡一段時間后固定于萃取臺上，設定萃取溫度和攪拌速率，將萃取針插入樣品瓶中，伸出萃取頭（至液面以上），以頂空方式萃取一定時間后縮回萃取頭。立即插入氣相色譜儀進樣口中，伸出萃取頭，于高溫進樣口解析一定時間，解析完成后縮回萃取頭并拔出萃取針，完成一次進樣過程。

1.3.2.1 平衡時間的選擇

將1 mL質量濃度為1 μg/mL的N-亞硝胺混合標準溶液置于15 mL樣品瓶中，加入9 mL飽和NaCl，置于40 ℃的恒溫水浴鍋里，N-亞硝胺不斷由液相揮發到氣相，最后達到在氣-液相中的分配平衡，平衡時間會影響采用SPME分析N-亞硝胺的結果。固定萃取溫度為35 ℃、萃取時間為45 min、攪拌速率為400 r/min、飽和NaCl作為萃取介質、解析時間為3 min，分析平衡時間分別為0、5、10、15 min對9 種N-亞硝胺萃取效果（N-亞硝胺的峰面積）的影響。

1.3.2.2 萃取條件的優化

在確定平衡時間后，對SPME的萃取條件進行單因素試驗。選擇萃取溫度分別為25、35、40、45、50、55 ℃（萃取時間30 min、攪拌速率400 r/min、飽和NaCl溶液），萃取時間分別為20、30、40、45、50 min（萃取溫度35 ℃、攪拌速率400 r/min、飽和NaCl溶液），攪拌速率分別為200、300、400、500、600 r/min（萃取溫度40 ℃、萃取時間30 min、飽和NaCl溶液），NaCl質量濃度分別為0、0.20、0.36 g/mL（萃取溫度40 ℃、萃取時間30 min、攪拌速率400 r/min），研究各因素對9 種N-亞硝胺的萃取效果。

1.3.2.3 解析時間的選擇

以質量濃度為1 μg/mL的混合標準溶液為萃取對象，在平衡時間10 min、萃取溫度40 ℃、攪拌速率400 r/min、

飽和NaCl溶液作為萃取介質的條件下萃取30 min，解析時間分別設定為2、3、4、5 min。根據色譜圖的出峰面積，確定最佳解析時間。

1.3.3 標準曲線的繪制

9 種N-亞硝胺的混合標準品用甲醇配制成質量濃度為200 μg/mL的標準儲備液，置于棕色瓶中，-20 ℃避光保存；取0.5 mL上述標準儲備液，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成質量濃度為10 μg/mL的混合標準工作液；將N-亞硝胺混合標準工作液進行逐級稀釋至質量濃度為0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 μg/mL，于最適分離條件下分別進樣，以N-亞硝胺的質量濃度為橫坐標，對應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程及相關系數。

1.3.4 方法的檢出限和定量限

分別將信噪比為3和10時測得的N-亞硝胺的濃度作為方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。

1.3.5 回收率實驗

采用空白基質加標的方法測定回收率，準確稱取肉樣1 g，分別添加1 mL質量濃度為0.8、1.0、2.0 μg/mL的N-亞硝胺混合標準溶液，加入8 mL飽和NaCl溶液，采用優化后的條件進行樣品前處理和GC-NPD分析。按照下式計算回收率。

式中：A2為加標后樣品中9 種N-亞硝胺的峰面積/pA；

A1為加標前樣品中9 種N-亞硝胺的峰面積/pA；A0為混合標準品中9 種N-亞硝胺的峰面積/pA。

1.3.6 精密度實驗

計算加標回收率實驗中5 次回收率平行測定結果的相對標準偏差（relative sandard deviation，RSD），分析加標回收率實驗的精密度。

1.4 數據處理

實驗均重復測定3 次，結果用平均值±標準差表示。數據統計及分析采用Statistix 8.1軟件包（St Paul，MN）中線性模型程序進行方差分析，采用Tukey HSD程序進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜條件優化及9 種N-亞硝胺標準品的色譜圖

樣品不經SPME處理，采用氣相色譜結合氮磷檢測器，用HP-INNOWax石英毛細管柱對9 種N-亞硝胺進行分離。由圖1可知，9 種N-亞硝胺都實現了基線分離，且各峰的峰形尖銳、對稱。采用程序升溫，50～180 ℃范圍內，以10 ℃/min的速率升溫，NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR和NMOR依次出峰，當溫度以20 ℃/min升到220 ℃時，NDpheA出峰。在分離過程中，流速分別選擇2、4、6 mL/min，當流速為4 mL/min和6 mL/min時，NDBA和NPIP沒有實現基線分離，當流速為2 mL/min時，二者實現基線分離。

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 平衡時間的選擇

平衡過程，即樣品于萃取瓶中在一定的溫度、攪拌速率下進行萃取，使溶液中的N-亞硝胺與頂空部分的

N-亞硝胺基本達到動態平衡。本研究選擇在40 ℃恒溫水浴鍋中進行平衡。由表1可知，9 種N-亞硝胺在平衡時間為10 min時的出峰面積最大，且NDMA、NMEA、NDEA、NPIP、NPYR、NMOR的峰面積顯著高于其他平衡時間（P<0.05），此結果與Andrade等[12]報道的平衡時間為10 min時臘腸中的NDMA和NDEA的峰面積最大一致，因此選擇10 min作為9 種N-亞硝胺的平衡時間。endprint

2.2.2 萃取條件的優化

2.2.2.1 萃取溫度的選擇

由表2可知，溫度為25～40 ℃時，除了NMEA，其他8 種N-亞硝胺的峰面積隨溫度升高而增加，且NDPA、NDBA、NPIP、NDpheA的峰面積增加顯著（P<0.05）。溫度為40～45 ℃時，NMEA、NDPA、NDBA、NMOR和NDpheA的峰面積隨溫度升高而增加，但差異不顯著（P>0.05），而NDMA、NDEA、NPIP和NPYR的峰面積隨溫度升高而減小，其中NDMA、NDEA和NPYR顯著降低；溫度繼續升高到55 ℃時，NMEA的峰面積顯著降低，NDPA和NMOR變化不顯著，NDBA和NDpheA顯著增加。這可能是因為45 ℃時的水蒸氣氣壓增加，造成萃取頭在吸附的同時也在進行脫附，當溫度升高到55 ℃時，其峰面積變化不顯著。考慮到NDMA、NDEA和NPYR是食品中的主要致癌物，且其他N-亞硝胺在45 ℃以上溫度的峰面積與40 ℃差異不顯著，因此選擇40 ℃作為最適萃取溫度。

2.2.2.2 萃取時間的選擇

由表3可知，除了NDEA，其他8 種N-亞硝胺的峰面積隨著萃取時間的增加整體呈增大趨勢，萃取50 min后萃取頭吸附N-亞硝胺基本上達到平衡，且NMEA、NDEA和NPYR在萃取30 min和50 min時的差異不顯著

（P<0.05），而且固相微萃取本身就是一種不完全萃取，考慮到快速萃取操作及進樣分析時間的可行性，最終選取30 min作為萃取時間。

2.2.2.3 攪拌速率的選擇

由表4可知，攪拌速率對9 種N-亞硝胺的峰面積有顯著影響（P<0.05），隨著攪拌速率的加快，9 種N-亞硝胺的峰面積并沒有明顯遞增趨勢，當攪拌速率為400 r/min

時，出峰面積達到最大。雖然攪拌速率為400 r/min和

300 r/min時，除NDBA、NPYR和NdpheA的峰面積差異顯著（P<0.05）外，其他6 種N-亞硝胺的峰面積差異均不顯著（P>0.05），但由于攪拌速率較好控制，因此為了使萃取效率達到最大，本研究選擇攪拌速率為400 r/min。

2.2.2.4 NaCl質量濃度的選擇

在待萃取的樣品中加入NaCl是為了降低待分析物在水溶液中的溶解度，促進待分析物的揮發，使水相和空氣相中的分析物達到平衡[29]。由表5可知，除NMOR外，其他8 種N-亞硝胺的峰面積隨著NaCl質量濃度的增加而增大；除NPYR和NMOR外，其他種類的N-亞硝胺在NaCl溶液飽和時，其出峰面積最大，且顯著高于質量濃度為0.00 g/mL和0.20 g/mL的NaCl溶液作為萃取介質時的峰面積（P<0.05）。因此選擇飽和NaCl溶液作為萃取介質進行萃取。

2.2.3 解析時間的選擇

萃取頭吸附的待測物在氣相色譜儀進樣口解析時間的長短對萃取效果有一定的影響。由表6可知，除NDBA、NPIP和NDpheA外，其他N-亞硝胺在解析時間為3 min時的出峰面積最大；NDEA解析3 min時的出峰面積顯著高于其他解析時間（P<0.05）；NDBA解析3 min時的出峰面積顯著高于解析2 min（P<0.05），與解析4、5 min時的差異不顯著（P>0.05）；NPIP解析3 min時的出峰面積顯著高于解析2、5 min（P<0.05），與解析4 min時的差異不顯著（P>0.05）；NDpheA解析3 min時的出峰面積與其他解析時間差異不顯著（P>0.05）。在對解析3 min后的萃取頭進行老化操作時，并沒有出現殘留峰及雜質峰，3 min的解析時間也確保了萃取頭的老化操作，因此選擇3 min作為最佳解析時間。

2.3 PDMS/DVB/CAR萃取頭萃取9 種N-亞硝胺的色譜圖

通過對平衡時間、萃取條件和解析時間進行優化，得到最優條件為平衡時間10 min、萃取溫度40 ℃、萃取時間30 min、轉速400 r/min、飽和NaCl溶液作為萃取介質，在此條件下將100 ng/mL的9 種N-亞硝胺的混合標準溶液萃取后，進行氣相色譜檢測。由圖2可知，9 種N-亞硝胺全部分離，但響應強度差異較大，這與萃取材料對目標物的吸附強度有關。

2.4 方法的線性范圍、檢出限、定量限、回收率和精密度

由表7可知，該方法的線性相關性較好，相關系數均大于0.99。9 種N-亞硝胺的檢出限為0.01～10.00 ng/mL，NDMA、NDEA、NDPA、NDBA的檢出限較低，可以滿足肉制品中這4 種N-亞硝胺的痕量檢測，其精密度和準確度均能滿足痕量分析的要求。

2.5 實際樣品測定

用SPME-GC-NPD方法，采用優化得到的最佳條件測定16 種魚肉類油炸制品中9 種N-亞硝胺的含量。由表9可知，16 種被測肉制品中存在的N-亞硝胺主要為NDMA、NMEA和NDEA，只有個別樣品中含有NDBA和NPIP。目前GB 2762—2012《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[30]中只對NDMA有限量規定（3 μg/kg），由本研究的測定結果可知，16 種被測肉制品中的NDMA含量均超過了此限量標準，特別是沒有限量規定的NMEA和NDEA的測定值特別高，如有的樣品中NMEA的測定值高達48.581 μg/kg。油炸制品中常被報道檢出的NPYR在本研究的樣品中并未檢出，主要原因是N-亞硝胺的檢測采用固微相萃取儀進行前處理，采用PDMS/DVB/CAR萃取頭，對NPYR的吸附力較差，因此NPYR含量較低的產品檢測不出來。N-亞硝胺是一種致癌性很強的化合物，應該予以重視。今后的研究應分析造成產品中N-亞硝胺含量較高的原因及N-亞硝胺形成的影響因素，跟蹤產品的加工過程，尋找控制措施。endprint

3 結 論

本研究建立了SPME結合GC-NPD測定肉制品中

9種N-亞硝胺的方法，該方法簡單、快速、不使用有機溶劑、易操作。以PDMS/DVB/CAR為萃取頭，解析時間3 min、平衡時間10 min、萃取溫度40 ℃、攪拌速率400 r/min、萃取時間30 min、飽和NaCl溶液作為萃取介質時，9 種N-亞硝胺的峰面積最大。9 種N-亞硝胺的質量濃度與對應峰面積間的線性關系良好，相關系數為0.994 9～0.999 7，檢出限為0.01～10.00 ng/mL，定量限為0.03～33.00 ng/mL，回收率為50.19%～93.20%，RSD為2.29%～9.65%。由于檢出限和回收率的限制，本研究中的方法僅可以滿足肉制品中NDMA、NDEA、NDPA和NDBA的定量測定。

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