一種快速檢測UGT1A1＊28基因多態性的方法

黃迎 蘇健 黃小穗 盧丹霞 謝至 楊素清 郭偉浜 呂志異 吳紅穗 張緒超

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1, UGT1A1 ）是伊立替康（irinotecan）的主要代謝酶，其活性與伊立替康的療效及不良反應密切相關，而UGT1A1*28基因多態性可顯著影響該酶的表達與活性，增加伊立替康化療患者發生腹瀉、嚴重粒細胞減少等不良反應的風險。伊立替康是小細胞肺癌標準二線治療方案，檢測UGT1A1*28基因多態性對于指導肺癌個體化治療具有一定臨床意義[1-4]。

目前檢測基因多態性常用的方法主要包括：Sanger測序法、變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC）、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis, DGGE）、單鏈構象多態性（single-strand conformation polymorphism, SSCP）、熒光定量PCR、PCR-LDR等多種。Sanger測序法是檢測UGT1A1*28突變的傳統和經典方法，但Sanger測序法耗時，且靈敏度低，僅達10%[5,6]。本研究嘗試用片段分析方法，以期快速、簡便地檢測UGT1A1*28多態性，獲得一種更適用于臨床的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 外周血DNA提取試劑盒（Qiagen公司），緩沖液、超純甲酰胺、POP4膠和GeneScan-500 LIZ Size Standard（美國Applied Biosystems，ABI公司）。3730基因分析儀（美國Applied Biosystems，ABI公司），QIAsymphony SP高通量全自動樣品純化工作站（Qiagen公司），Nano Drop 8000分光光度計（Thermo公司），PCR儀（北京東勝創新生物科技公司），水平電泳儀（德國BIO-RAD公司），UVI凝膠成像系統（德國BioRad公司）。

1.2 樣本及質控品 286例樣本均取自廣東省人民醫院2014年4月-2015年5月住院肺癌患者，抽取靜脈EDTA抗凝全血1 mL。患者臨床特征見表1，所有患者均簽署知情同意書；10份UGT1A1*28質控品來源于國家衛計委。

1.2.1 引物合成 片段分析引物：上游引物：5’FA M-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA3’，下游引物：5’TAGCACCTGACGCCTCGTTGT3'；擴增產物為1 2 8 b p。S a n g e r測序上游引物：5’CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA3’；下游引物：5’ACAACGAGGCGTCAGGTGCTA3’均由Life公司合成。

1.2.2 DNA提取 按試劑說明書提取基因組DNA，測OD值，并配成10 ng/μL。

1.2.3 PCR擴增 總反應體系10 μL，含Premix Ex Taq Hot Start Version 5 μL（大連TAKARA公司），DNA模板1 μL，2 μM上下游引物各0.5 μL，ddHO23 μL。擴增條件為：94oC預變性3 min，94oC變性30 s，55oC退火30 s，72oC延伸1 min，共30個循環。反應結束后4oC保存。每次實驗均加一個無模板空白對照。

1.3 基本掃描分析 取熒光標記的PCR產物1 μL，加69 μL水作1:70稀釋，取1 μL稀釋產物與0.5 μL Genescan-500 LIZ Size Standard及9 μL去離子甲酰胺混合，在ABI-3730 DNA序列分析儀中進行毛細管電泳。計算機自動收集電泳過程中不同時間所出現的不同顏色和強度的熒光素，以顯示出不同的位置、高度、顏色和形態的峰；Gene Scan Genotyper 3.5軟件自動分析收獲的數據。

1.4 確定方法學的準確度、精確度及最低檢測限 將DNA配制成不同的濃度（1 ng/μL、2.5 ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL、20 ng/μL），每個濃度檢測三個復孔，以確定檢測方法的最低檢測限。所有樣本及質控品均用Sanger測序法同時檢測以確定檢測的準確度；取4份樣本由兩個操作者分兩個批次進行檢測以確定重復性。

1.5 Sanger測序 使用本室建立起來的方法，簡述如下：PCR反應體系：每個25 μL的PCR反應包括1 μL（20 ng/μL）模板DNA，12.5 μL Premix Ex Taq HS酶（大連TAKARA公司），1 μL正向和反向引物混合物，10.5 μL ddH2O。PCR反應條件為：初始變性94oC 5 min：變性94oC 30 s，退火55oC 30 s，72oC延伸1 min，35個循環；72oC延伸7 min。將擴增的PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段符合條件后，純化產物。純化的PCR產物用BigDye Teminator V3.1按操作說明書進行標記及純化，然后在ABI-3730測序儀上進行雙向測序，測序結果用Chromas 2.31軟件分析，人工校讀分析UGT1A1上游啟動子序列A（TA）nTAA中的TA重復序列。

1.6 樣本檢測 先取20例樣本作為實驗集，同時用片段分析法及Sanger測序法檢測UGT1A1*28多態性，確定三種基因片段在毛細管電泳時的位置；其余266例為驗證集，與10份質控品一起同時用片段分析法及Sanger測序法檢測UGT1A1*28多態性。

2 結果

2.1 臨床特征 286例肺癌患者的臨床特征見表1，肺腺癌181例，鱗癌67例，小細胞肺癌17例，其他病理類型21例。17例小細胞肺癌中，7例放棄治療；在10例接受了化療的患者中，有3例分別接受一線、二線和三線依立替康治療，均無不可耐受的嚴重不良反應，基因型均為TA6/6型。

2.2 片段分析數據判讀 電泳結束后，GenScan3.5軟件自動分析生成的圖譜文件，給出各片段位置、峰值大小。由于PCR引物標記上了VIC熒光，UGT1A1不同的分子分型在毛細管電泳圖上產生位置和峰高不同的綠色產物峰。通過實驗集的20例樣本確定UGT1A1三種多態性的峰圖特征：單個124.2大小的峰為TA6/6型，單個126.4大小的峰為TA7/7型，124.2及126.4兩個峰為TA6/7型（圖1）。

2.3 片段分析 片段分析10個質控品結果完全正確（表2）。DNA最少上樣量為1 ng/μL，不同操作者兩批次檢測的結果完全一致。

2.4 兩種方法一致性結果 286例樣本通過片段分析法檢測出UGT1A1*28為TA6/TA6 236例（82.5%），TA6/TA7為48例（16.8%），TA7/7為2例（0.7%）；與Sanger測序結果呈一致性，準確度達100%。10份質控品結果百分之百正確。

3 討論

圖1 UGT1A1*28基因分型圖例。A、B：UGT1A1*28 TA6/6野生型，峰的位置位于124.2；C、D：UGT1A1*28 TA 7/7純合突變型，峰的位置位于126.4；E、F：UGT1A1*28 TA6/7雜合型，有兩個峰，位置分別為124.2及126.4；A、C和E是片段分析圖譜；B、D及F是Sanger測序圖譜。Fig 1 Representative figures of UGT1A1*28 polymorphysin. A, B: UGT1A1*28 TA6/6. The trace is located in 124.1; C, D: UGT1A1*28 TA 7/7. The trace is located in 126.4; E, F: UGT1A1*28 TA6/7. There are two traces which are located in 124.2 and 126.4, respectively. A, C and E are generated with fragment analysis, while B, D and F are generated with Sanger sequencing.

表1 286例患者的臨床特征及UGT1A1*28多態性Tab 1 Characteristics of patients with lung cancer and UGT1A1*28 polymorphism

表2 片段分析檢測10例UGT1A1質控品結果Tab 2 Results of 10 standards detected with Sanger sequencing and Fragment analysis

本研究建立一種片段分析法快速檢測UGT1A1*28多態性，一共檢測286例肺癌患者血液標本，與Sanger測序比較，準確性均達100%，參加國家衛計委室間質評結果完全正確。最少DNA用量可達1 ng/μL。3例小細胞肺癌患者分別接受一線、二線和三線依立替康治療，均無不可耐受的嚴重不良反應，基因型均為TA6/6型。

UGT1A1啟動子區域的TATAA區若插入一個TA，即A（TA）7TAA；野生型則為A（TA）6TAA。UGT1A1*28多態性有三個基因型：TA6/TA6（野生型）、TA6/TA7（雜合突變型）和TA7/TA7（純合突變型）。TA6/7和TA7/7基因型的UGT1A蛋白質的代謝中間產物SN-38的糖脂化作用下降，因而增加了伊立替康的毒副作用，臨床通過減少藥物用量，可以減輕毒副作用，但對藥物療效影響不大，因此，UGT1A1*28基因的多態性有助于指導臨床用藥[1-4]。

目前，檢測UGT1A1*28基因的多態性的方法主要是Sanger測序法[7,8]，但Sanger測序法步驟繁瑣、一個檢測周期需要兩天，結果判讀較復雜，不能為臨床提供快速的檢測服務。

片段分析方法基本工作原理是用熒光標記的引物擴增DNA目的片段，若目的片段由于突變導致片段大小發生改變，將熒光標記的PCR產物置于ABI-3730基因分析儀上進行毛細管電泳，電泳結果用GenScan 3.5軟件進行分析，電泳圖上出現兩個位置不一樣的峰形，根據產物峰的位置大小可作出結果判斷。毛細管電泳分辯率高，可以區分1個堿基的差異。由于此技術操作簡便、耗時短、費用少，已得到廣泛的應用。Furtado等[9]在真性紅細胞增多癥樣本中比較Sanger測序法、熔解曲線法（high resolution melting,HRM）及片段分析法檢測JAK2基因12外顯子的突變，包括缺失突變、插入突變、K539L點突變，發現片段分析更靈敏，可檢測突變含量為2%的樣本（極限為0.5%），而HRM法及Sanger測序靈敏度則為10%；片段分析法結果解讀更容易。該研究者設計了單管檢測JAK2基因缺失突變、插入突變、K539L突變，提高了檢測通量，缺點是不能同時檢測其他類型的點突變。Gardner等[10]在47例血液腫瘤標本中比較了片段分析法、Sanger測序法及二代測序法檢測CALR基因外顯子9的缺失及插入突變。發現1例缺失突變，2例插入突變；片段分析法與Sanger測序法結果完全一致，二代測序法用常規流程檢測時，該1例缺失突變未能檢測，用IGV軟件分析，發現是因為該區域的復蓋度不夠導致結果為陰性。但IGV可同時發現1個小缺失及幾個點突變。

UGT1A1*28基因在啟動子區域的TATAA盒在野生型為6個TA，其多態性插入了一個TA，野生型及突變型DNA片段之間相差兩個堿基，在毛細管電泳時可以明顯區分開來。本研究中所建立的片段分析法DNA用量少，可節約樣本量；檢測通量高（一次可檢測96個樣本），檢測周期短，一個檢測周期僅需1天；精確度及準確度均達到100%；成本低，適用于臨床檢測。近幾年，雖然二代測序法以更高的靈敏度及更高的通量廣受矚目，但也因其存在一定的錯誤率及高費用、高技術要求，讓基層單位望而卻步。

毛細管電泳時，DNA產物的上樣量對電泳圖譜的質量影響較大，上樣量過少，產物峰過低，可能會導致實驗失敗；若上樣量過大，背景過高可導致誤判結果。用水稀釋PCR產物至一合適濃度，使產物的峰高與分子量標記LIZ500的峰高相當，則電泳圖譜為最佳。

有研究[11,12]認為：依立替康毒副作用與UGT1A1*6多態性有強相關關系而與UGT1A1*28多態性非相關；也有研究指出在亞裔患者中，依立替康毒副作用與UGT1A1*6/28均非相關。由于本研究小細胞肺癌的病例數較少，且沒有檢測UGT1A1*6多態性，未能闡明中國小細胞肺癌患者依立替康毒副作用與UGT1A1*6/28多態性的相關性。

綜上所述，片段分析法適用于臨床檢測UGT1A1*28多態性，成本低且方便快捷。