HPLC測定雙向固體發酵過程中人參皂苷成分的變化

楊慧萍，李軒

（1．新疆伊犁哈薩克自治州伊寧市友誼醫院藥劑科，新疆 伊寧 835000；2．新疆伊犁哈薩克自治州中醫院藥劑科，新疆 伊寧 835000）

HPLC測定雙向固體發酵過程中人參皂苷成分的變化

楊慧萍1，李軒2

（1．新疆伊犁哈薩克自治州伊寧市友誼醫院藥劑科，新疆 伊寧 835000；2．新疆伊犁哈薩克自治州中醫院藥劑科，新疆 伊寧 835000）

目的：研究人參在雙向固體發酵過程中，不同發酵時間下人參菌質中人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd及人參總皂苷的含量變化情況。方法：采用高效液相色譜法測定各發酵時間下人參菌質中人參總皂苷以及上述6種人參皂苷的含量。結果：隨著發酵時間的延長，人參皂苷Re、Rg1、Rb1的含量總體呈降低趨勢，人參皂苷Rd、Rh1的含量總體呈上升趨勢，人參總皂苷的含量有所減少。結論：隨著發酵時間的延長，人參皂苷含量發生變化，人參皂苷發生了轉化。

人參皂苷；高效液相色譜法；雙向固體發酵

人參為五加科植物人參的干燥根和根莖，首見《神農本草經》中，列為上品，具補五臟、定魂魄、除邪氣、安精神、明目益智等功效[1]。人參在現代臨床上對疾病防預和人體滋補強壯方面具有很好效果，可用其治療四肢冰冷、心力衰竭、脈象虛弱以及休克等疾病[2]。隨著人們對人參不斷地深入研究，人參中的活性成分及其藥理作用逐漸地被發現[3]。研究表明，人參中主要有效成分為人參皂苷，約占4%，且到目前，已分析鑒定出的人參皂苷單體達40余種[4]。通過國內外的學者們對人參皂苷藥理活性的研究，發現其藥理作用主要集中于抑制癌細胞的轉移、誘導細胞的凋亡、抗突變、保護心腦血管和增強免疫功能等[5]，通常對于二醇組皂苷來說藥理活性的不同是由于皂苷分子結構中的糖基側鏈不同所致[6]。然而，野生人參藥用資源極為稀少，采用人工栽培技術的周期較長且成本高，其藥材價格不斷升高等因素極大地限制了對人參的研發和應用[7]。近年來，采用一些新技術，如微生物轉化、化學合成、組織培養等，能更高更快地獲取目標化合物，成為一種有效的獲取資源途徑[8]。對于人參皂苷來說，利用生物體外轉化則能有效地改變其糖鏈結構，從而提高稀有活性皂苷的含量，具有一定的經濟價值[9]。固體發酵是人參皂苷體外轉化的一種常用方法，該過程是雙向發酵的過程，一方面人參藥材作為基質為菌體提供營養，另一方面菌體代謝產生的酶將原有的人參皂苷進行結構修飾轉化為活性更高的稀有人參皂苷，此方法工藝比較簡單，質量易控制，產率較高，適合于工業大生產[10]。

本實驗采用高效液相色譜法測定不同發酵時間下人參菌質中人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rd、Rf及人參總皂苷的含量。此方法測定人參皂苷含量具有快速、簡單、特征性良好等特點[11]，可作為人參藥材質量控制的重要指標[12]。為人參藥材生物轉化的質量控制提供實驗依據和參考。

1 材料與儀器

人參產自吉林長白山地區，主要試劑：人參皂苷標準品（Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd購于中國藥品生物制品檢定所）；甲醇、乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑為分析純。HH-4型數顯恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠）；十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器公司）；立式壓力蒸汽菌器HYXQ-LS-50A（上海博迅實業有限公司）；KQz3200E型超聲波清洗機（天鵬電子新技術有限公司）；安捷倫-1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；色譜柱InertsilODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm，GL Sciences lnc）；DIF-6090型真空干燥箱（上海一恒實驗儀器總廠）；SZ-97型自動純水蒸餾器（上海亞蓉儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取對照品人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得[13]。

2.2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；檢測波長為203 nm；柱溫30℃；流速1.0 mL/min。理論板數按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6 000[13]。

2.3 線性關系試驗

精密吸取對照品人參皂苷Rg1、Re、Rb1溶液2，5，7，10，13 μL；精密吸取對照品人參皂苷Rh1、Rf、Rd溶液2，4，8，10，12，20 μL，按上述色譜條件測定峰面積值。以峰面積的積分值為縱坐標Y，以標品人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd的進樣量為橫坐標X，繪制標準曲線，見表1。

表1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd標準曲線

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復進樣6次，得其峰面積。結果為人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd對照品的RSD分別為0.95%，0.73%，0.98%，1.97%，1.71%，1.74%，表明精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密吸取人參皂苷Rh1、Re、Rg1、Rb1、Rf、Rd對照品溶液與供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件，測定24 h內峰面積值，對照品中人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rh1、Rf、Rd的RSD為0.87%，0.59%，1.57%，2.94%，2.42%，2.30%；供試品中人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd的RSD為0.99%，1.40%，1.70%，2.80%，2.22%，2.73%，表明穩定性良好。

2.6 重復性試驗

取發酵粉末6份，每份1 g，精密稱定，按供試品溶液項下依法測定，取10 μL，按上述色譜條件，測定峰面積，并代入相應標準曲線，計算人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd的含量。試驗結果為人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rf、Rd精密度的RSD為 2.71%，2.68%，2.97%，0.77%，2.30%，2.57%，表明重復性好。見表2。

2.7 回收率試驗

精密稱取樣品0.5 g，加入適量人參皂苷Rh1、Re、 Rg1、Rb1、Rf、Rd對照品，依法制備及測定，并計算加樣回收率。試驗結果為人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd平均加樣回收率的為100.4%，102.66%，96.83%，96.4%，98.94%，99.29%；其RSD%分別為2.15%，1.52%，1.01%，1.46%，2.47%，2.84%表明準確性良好。見表3。

表2 重復性試驗

表3 回收率試驗 （%）

2.8 人參總皂苷的含量測定

2.8.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.8.2 標準曲線的制備 標準品溶液的制備：取人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.8.3 人參藥材供試品溶液的制備 取人參粉末（過60目篩）約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒放入錐形瓶中，精密加入50 mL水飽和正丁醇液，超聲處理30 min，冷卻，過濾，精密吸取續濾液25 mL，蒸干。殘渣加10 mL水溶解，通過已處理好的D101大孔樹脂柱（12 cm×1.5 cm），吸附1 h，先用100 mL蒸餾水洗脫，棄去水液，再用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液蒸干。殘渣加甲醇溶解，定容于50 mL量瓶中，即得。

2.8.4 發酵產物供試品溶液的制備 取發酵產物粉末（過60目篩）1 g，置于索氏提取器中，加三氯甲烷回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒放入錐形瓶中，精密加入50 mL水飽和正丁醇液，超聲處理30 min，冷卻，過濾，精密吸取續濾液25 mL，蒸干。殘渣加10 mL水溶解，通過已處理好的D101大孔樹脂柱（12 cm×1.5 cm），吸附1 h，先用100 mL蒸餾水洗脫，棄去水液，再用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液蒸干。殘渣加甲醇溶解，定容于50 mL量瓶中，即得。

2.8.5 測定方法 精密吸取本品0.6 mL，按“2.8.2”項下的方法，自“置于具塞試管中”起依法操作，測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中人參皂苷Re的量，計算結果乘以0.84，即得[13]。 2.8.6 實驗結果 各發酵終點時人參皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd及人參總皂苷含量，見表4。

表4 人參皂苷及其總皂苷含量 （mg/g）

3 結論

3.1 實驗數據表明：人參在雙向固體發酵的過程中，人參皂苷的含量發生了變化，人參皂苷Rd發酵9 d后含量明顯升高，發酵24 d時含量達到最高；人參皂苷Rh1含量總體有所升高；人參皂苷Re、Rf、Rg1、Rb1的含量總體呈下降趨勢，其中Rb1下降趨勢較明顯，Rf含量無明顯變化；人參總皂苷的含量總體有所減少；發酵過程中人參皂苷有部分發生轉化。

3.2 近年來，人參的體外轉化技術越來越受到人們的關注，然而相比細菌、酶催化的方法，使用真菌進行發酵具有操作簡單、成本低廉的優勢[14]。本實驗采用高效液相色譜法來測定人參在固體真菌發酵的過程中，不同發酵時間下人參菌質中人參皂苷的含量情況，總結出人參雙向發酵后6個人參皂苷及人參總皂苷的含量變化，為人參藥材生物轉化研究的質量控制提供實驗依據，為人參產品的研發和使用提供參考。

從實驗數據上可以看出，經過不同的發酵時間，人參皂苷的含量發生了變化，這種轉化有利于獲取更高含量的目標產物。其中值得特別關注的是人參皂苷Rd在發酵的過程中含量不斷升高，24 d時含量達到最高，這說明在此發酵條件下有利于提高人參皂苷Rd的含量。Rd為稀有人參皂苷，其在植物體內含量較低，腸道酶可以將Rb1代謝為Rd[15]。其藥理作用廣泛，除與其他人參皂苷相似之處之外，還具有一些獨特的藥理作用。其主要藥理作用有保護心腦血管、清除自由基、抗衰老、調節免疫、抗腫瘤等方面。

從數據還可發現，人參皂苷Rb1的含量明顯下降，可以推測，在此發酵過程中在菌體代謝產生的酶的作用下人參皂苷Rb1轉化為了Rd。

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本文編輯：魯守琴

Determine Changes of Ginsenoside Components During Bidirectional Solid Fermentation Course by HPLC-ELSD

Yang Hui-ping1, Li Xuan2
(1.Department of Pharmacy, The Friendship Hospital of Yining City, Kazak Autonomous Prefecture of Yili in Xinjiang, Xinjiang Yining 835000, China; 2. Department of Pharmacy, the Chinese Medicine Hospitall of Yining City, Kazak Autonomous Prefecture of Yili in Xinjiang, Xinjiang Yining 835000,China)

Objective：Study the influence on ginsenosides Re, Rg1, Rh1, Rb1, Rf, Rd and the content of total saponins of Panax ginseng under different fermentation time during the bidirectional solid fermentation course. Methods：Using HPLC to measure the content of total saponins of panax ginseng and above 6 ginsenosides which under different fermentation time. Results：With the extension of the fermentation time, the content of ginsenosides Re, Rg1, Rb1were overall gradually decreasing, the content of ginsenoside Rd, Rh1were overall gradually increasing, and the content of total saponins of panax ginseng was decreased. Conclusion：With the prolongation of fermentation time, the content of ginsenosides was changed, and the transformation was happened.

Ginsenoside; HPLC; Bidirectional Solid Fermentation

R284.1

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.07.021

2017 - 04 - 19

楊慧萍，女，主管藥師。研究方向：臨床藥學。E-mail：yhp6222@163.com

李軒，女，藥師。研究方向：臨床藥學。E-mail：yhp6222@163.com