14個辣椒雜交種純度鑒定的SSR引物篩選

杜培粉

（湖南湘研種業有限公司，長沙，410100）

14個辣椒雜交種純度鑒定的SSR引物篩選

杜培粉

（湖南湘研種業有限公司，長沙，410100）

利用73對多態性較好的辣椒SSR引物，對湘研種業的14個辣椒品種進行差異性篩選，結果表明，每個品種都有1對以上SSR引物可將其父本、母本及F1代區分開；同時對每個品種的多個批次進行驗證，檢測結果與田間檢測結果基本相符。因此，可利用SSR分子標記技術進行辣椒種子室內純度鑒定，且具有簡單、快速、準確、重復性好等優點，SSR分子標記在辣椒種子室內純度快速檢測方面具有很大的應用前景。

辣椒；SSR標記；純度鑒定

辣椒（Capsicum annuumL.）屬茄科辣椒屬，原產中南美洲，在溫帶地區為一年生植物，是我國主要的蔬菜，也是重要的調味品，其栽培面積在我國蔬菜作物中位居第二。辣椒營養豐富，維生素C含量在蔬菜中居首位，還含有豐富的辣椒堿、辣椒素、胡蘿卜素、檸檬酸、茄堿等有益物質，具有增強食欲、幫助消化、增強人體抵抗力、抵御多種疾病的作用。在植物育種和種子生產的過程中，F1代雜交種的純度鑒定工作是種子質量控制的一個重要環節，隨著育種進程的加快，辣椒品種越來越多，對優質雜交種的種類和需求量日益增加，使辣椒雜交種質量鑒定研究工作顯得極其重要。

SSR標記也稱微衛星 DNA（Microsatellite DNA），是近年來發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術。與其他分子標記（AFLP、RAPD、RFLP等）相比，SSR標記具有以下優點：①多態性高，覆蓋整個基因組；②具有多等位基因的特性，提供的信息量高；③以孟德爾方式遺傳，通常呈共顯性標記，具有很好的穩定性，可以鑒別純合體和雜合體；④所需DNA量少等。SSR標記技術廣泛應用于遺傳多樣性的研究、親緣關系的研究以及構建遺傳連鎖圖譜和基因定位。

近年來，利用SSR標記技術進行雜交種純度鑒定在玉米、棉花等作物上[1～3]均有報道，但辣椒上很少見。利用SSR標記技術，篩選出適合14個雜交種室內純度鑒定的SSR引物，初步建立了辣椒雜交種種子室內純度鑒定的SSR體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的14個辣椒品種全部來自湖南湘研種業有限公司，是2014年秋季制種。試驗于2015年進行。每個品種取100粒種子，均勻播在發芽盒中，于恒溫箱中30℃放置8 d，待長出第一片真葉時進行試驗。

1.2 方法

①辣椒總DNA的提取 取發芽一周的雜交種及其父母本的幼苗，參照CTAB法提取DNA[4]，由于純度鑒定的樣本量較多，為提高工作效率，且保證DNA質量，將CTAB法進行簡化，在轉換離心管時直接轉到96孔板中，這樣得到的DNA不僅濃度足夠高，且純度也很高，保證了下一步試驗準確、方便、快速進行。

②PCR反應10 μL反應體系 10×PCR Buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，引物0.3 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U 0.1 μL，用無菌水補充到10 μL。反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，35個循環；72℃延伸10 min，10℃保存。

③電泳檢測PCR反應產物 利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（220 V，60 min），檢測PCR擴增產物，電泳完成后，利用銀染色法，觀察記錄，找出父母本間有差異的條帶，重復性好，且擴增條帶清晰的SSR引物，用于雜交種純度鑒定。

圖1 14個辣椒品種SSR引物篩選電泳圖

2 結果與分析

2.1 SSR引物的篩選

利用SSR分子技術進行純度檢測，首先要篩選出父母本帶型互補的特征引物，且帶型清晰、差異明顯。本試驗用73對SSR引物（由上海英濰捷基生物公司合成），對14個雜交種及其父母本進行PCR擴增，每個品種都有一對以上的特征引物可用，這些特征引物能清晰地將相應的雜交種及其父母本區分開（圖1），并可鑒定出其他的混雜品種。從試驗結果可以看出，CA-336-2和CA-644-5分別可以鑒定5個雜交種，CA-117-6可以鑒定3個雜交種，CA-864-1、CA-089-3和CA647-2可以鑒定3個雜交種（表1），所用引物序列見表2。

2.2 雜交種的純度鑒定

利用篩選到的特征性引物，對公司制的批量種子進行純度鑒定，提取雜交種及其相應的親本 DNA進行 SSR分析，經電泳、染色、讀帶。圖2中母本條帶清晰可見，說明雜交種中有未授上粉的母本，圖3未發現雜帶，圖4中出現了不同于親本及雜交種的帶型，認為是異品種，統計的室內分子純度結果與田間純度鑒定結果相比較，結果基本吻合（表3）。這說明本試驗篩選的SSR引物可用于雜交種的純度檢測，且結果具有可靠性和實用性，可為種子的提前銷售提供一定的依據。

3 討論

表1 試驗所用14個品種名稱及其純度鑒定的特征引物

表2 用于室內鑒定較好用的引物序列

分子標記技術已應用于作物種質資源和遺傳育種的研究[5，6]，特別是在構建指紋圖譜和標記目的性狀基因方面取得了進展。楊娟等[7]將SSR標記和SCAR標記結合起來，建立多重PCR技術，進行辣椒恢復基因及其等位基因純合狀態的選擇，顯著提高了辣椒雄性不育三系的選擇效率。但多數分子標記方法所需的試驗成本較高、技術難度大、或穩定性差，只能適用于相關的科學研究，很難在種子企業推廣。本研究采用簡化的CTAB法，解決了大批量提取DNA的問題，既節省了費用，又保證了DNA質量，縮短了純度檢測的時間。目前，分子標記育種技術尚不成熟和完善，還不能作為一種育種方法單獨使用，辣椒上SSR標記的研究剛起步，已經開發的SSR標記較少[8]，隨著更多辣椒SSR位點的開發及研究應用，將進一步推動SSR標記在種子純度檢驗、遺傳育種及其他研究領域中的應用。而我國傳統育種經驗豐富，將分子標記這一先進技術與育種家的豐富經驗相結合，能使分子標記輔助選擇發揮其更大的作用。

圖2 大果99純度鑒定電泳圖（引物為CA-089-3）

圖3 湘研166純度鑒定電泳圖（引物為CA-117-6）

圖4 湘研五號純度鑒定電泳圖（引物為CA-864-1）

表3 14個辣椒品種室內純度與田間純度比較

[1]蓋樹鵬，蓋偉玲，王日新.6個玉米雜交種種子純度的SSR鑒定[J].種子，2010，29（7）：44-47.

[2]謝皓，陳學珍，于同泉，等.一種大豆品種純度鑒定方法與程序的建立[J].種子，2007，26（9）：104-107.

[3]朱美霞，李英芝，王建書，等.利用SSR方法鑒定棉花品種純度[J].安徽農業科學，2005，33（11）：2 010-2 016.

[4]王灝，王道杰，譚小力，等.用于RAPD分析的油菜總DNA的快速提取[J].西北農業學報，2001，10（3）：32-34.

[5]羅玉娣，李建國，李明芳.用SSR標記分析辣椒屬種質資源的遺傳多樣性[J].生物技術通報，2006（zl）：337-341.

[6]何建文，楊文鵬.SSR標記技術在辣椒遺傳育種中的應用[J].種子，2008，27（11）：81-83.

[7]楊娟，王雯，沈火林.辣椒恢復基因SSR標記定位及分子標記輔助選擇育種[J].中國瓜菜，2010，23（5）：1-5.

[8]Lee J M,Nahm S H,Kim Y M,et al．Characterization and molecular genetic mapping of microsatelliite loci in pepper [J]．Theor Appl Genet,2004,108:619-627．

Screening of SSR Primers for Purity Identification of 14 Hybrid Pepper Cultivars

DU Peifen
(Hunan Xiangyan Seed Industry Co.,Ltd.,Changsha 410100)

By using 73 pairs of pepper SSR primers with better polymorphism,the differerce screening experiment of 14 pepper cultivars from Xiangyan Seed Industry Co.,Ltd.was carried out.The results showed that for each cultivar,there was more than one pair of SSR primers could distinguish their male parent,female parent and F1generation.At the same time,the verification experiment about many batches of each cultivar was also carried out,and the detection results were consistent with the field testing results.Therefore,SSR molecular marker technology could be applied on the indoor seed purity identification of pepper,and it had the advantages of simple,rapid,accurate and reproducible,which had a wide application prospect in the rapid detection of indoor purity of pepper seeds.

Pepper;SSR markers;Purity identification

S641.3

A

1001-3547（2017）14-0046-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.14.017

杜培粉，女，碩士，助理研究員，主要從事辣椒新品種選育及分子標記輔助育種，電話：0731-82791257，

E-mail：251222713@qq.com

2017-06-13