茶黃素對白介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞炎性退變的影響

周盈，黃倩，王帥，陳萍

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，杭州310058；2.浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州310058）

茶黃素對白介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞炎性退變的影響

周盈1?，黃倩2?，王帥2，陳萍1*1

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，杭州310058；2.浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州310058）

采用白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）對體外培養(yǎng)的正常大鼠軟骨細胞進行誘導(dǎo)，構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）炎性退變細胞模型，探討茶黃素（theaflavins,TFs）治療骨關(guān)節(jié)炎的可行性。通過甲苯胺藍及免疫熒光染色對細胞進行鑒定，利用CCK-8細胞活力檢測篩選TFs藥物濃度；取第2代生長狀況良好的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞，根據(jù)所加培養(yǎng)物的不同將實驗分為3組：空白組G0、模型組G1（10 ng/mL IL-1β刺激）、TFs組G2（不同濃度的TFs+10 ng/mL IL-1β刺激），通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測各組Ⅱ型膠原（typeⅡcollagen,ColⅡ）、蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinases-13,MMP-13）、IL-1β及環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）mRNA的表達。結(jié)果表明，甲苯胺藍及免疫熒光染色結(jié)果呈陽性，證實體外分離培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞。CCK-8檢測結(jié)果顯示：TFs質(zhì)量濃度在100 μg/mL時，細胞活力較空白組明顯減弱（P＜0.05）；TFs質(zhì)量濃度在0～75 μg/mL時不影響軟骨細胞活力。qRT-PCR結(jié)果表明：與空白組相比，模型組中合成因子ColⅡ和ACAN mRNA表達量極顯著降低（P＜0.01），分解因子MMP-13、炎癥細胞因子IL-1β及炎癥誘導(dǎo)酶COX-2 mRNA表達量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，TFs組能抑制IL-1β引起的炎癥相關(guān)因子mRNA的表達，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。綜上所述，茶黃素可通過增強軟骨細胞合成因子活性、減弱分解因子活性并抑制細胞炎癥反應(yīng)，有效延緩大鼠軟骨細胞炎性退變進程，對炎癥軟骨細胞有一定的保護作用。

茶黃素；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞；白介素-1β；環(huán)氧合酶-2；炎性退變

Summary Osteoarthritis(OA)is a degenerative joint disease with an obviously increasing morbidity as age increases,which seriously affects old people’s joint function and life quality.The key to pathological changes in OA is the damage and loss of articular cartilage.Inflammatory cytokines,such as interleukin-1β(IL-1β),could induce cartilage degeneration and inflammatory reaction through a series of cascade reactions,especially in cartilage lesions.Theaflavins(TFs)are the main active ingredients of black tea polyphenols with anti-inflammation and antioxidant functions.This study focuses on the protective effects of TFsagainst inflammatory degeneration of rat chondrocytes and evaluates the feasibility of TFs in the treatment of OA.

Male Sprague-Dawley rat’s knee articular chondrocytes were isolated and cultured in vitro,which were identified by toluidine blue staining and typeⅡcollagen immunofluorescence staining.To select the concentration levels of TFs,cell viability was analyzed with a cell counting kit-8(CCK-8)assay.Three groups were set in this experiment according to different cultures: blank control group G0,model group G1(10 ng/mL IL-1β)and TFs group G2(different concentrations of TFs+10 ng/mL IL-1β). The changes in the mRNA expression levels of two anabolic factors ColⅡ(typeⅡcollagen)and ACAN(aggrecan),the main catabolic factors MMP-13(matrix metalloproteinases-13),IL-1β,and COX-2(cyclooxygenase-2)in rat chondrocytes were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR).

It can be found from the inverted phase contrast microscopy that IL-1β obviously impaired normal rat chondrocyte morphology.It can be seen from the fluorescent microscope that the cell nucleus was stained to be blue and cytoplasm was stained to be green by typeⅡcollagen immunofluorescence staining,and the extracellular matrix of cells was stained to be blue-purple by toluidine blue staining,which means the cultured cells in the experiment are chondrocytes.The CCK-8 assay indicated that 100 μg/mL TFs significantly decreased the cell viability of normal rat chondrocytes(P＜0.05),but 0-75 μg/mL TFs had no significant cytotoxicity to chondrocytes.The results of qRT-PCR showed that compared with the control group,the mRNA expression levels of chondrocyte markers(ColⅡand ACAN)were obviously down-regulated in the model group(P＜0.01),and the mRNA expression levels of MMP-13,IL-1β and COX-2 increased obviously in the model group(P＜0.05).For the changes,however,the gene expressions of these inflammatory related factors were significantly inhibited by TFs in a dose-dependent manner compared with the model group(P＜0.05).

In conclusion,TFs could effectively alleviate the inflammatory degeneration of rat chondrocytes,via up-regulating anabolic activity,down-regulating catabolic activity and inhibiting inflammatory reaction,so as to protect rat chondrocyts from OA induced by IL-1β.This study provides the first evidence that TFs can significantly inhibit OA disease progression and exert a palliative effect.

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，主要是由關(guān)節(jié)磨損退化而引起的關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，OA多見于65歲以上人群，發(fā)病率高達80%，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹、活動受限甚至畸形等，是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因[2-3]。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細胞，在軟骨形成、代謝修復(fù)中起著重要的作用。骨關(guān)節(jié)炎最重要的病理變化是軟骨退變。相關(guān)研究報道表明，驅(qū)動關(guān)節(jié)軟骨退變進程的主要因素是慢性炎癥及關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）的降解[4]。炎癥細胞因子通過改變軟骨細胞微環(huán)境，引起ECM合成和分解代謝失衡，致使關(guān)節(jié)軟骨退變，進而促進OA發(fā)展進程[5-6]。大量研究證實，白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）在OA軟骨基質(zhì)合成分解代謝中起到關(guān)鍵作用，可通過促進ECM基質(zhì)降解[7]，刺激軟骨細胞分泌更多的促炎因子和炎癥介質(zhì)[8]，進一步干擾細胞功能，在細胞與細胞外基質(zhì)之間形成一種正反饋通路，促進OA發(fā)展。

茶葉起源于我國，至今已有近3 000年歷史，其藥用價值也早有記載。茶黃素（theaflavins,TFs）是紅茶中決定色香味及品質(zhì)的主要功能成分，是一種極具開發(fā)潛力的藥物資源。TFs屬于紅茶多酚，主要由兒茶素和沒食子酸等酚類物質(zhì)氧化形成，其主要的單體有4種：茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3′-沒食子酸酯及茶黃素雙沒食子酸酯，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。近年來，TFs抗炎生理活性研究受到廣泛關(guān)注，現(xiàn)已證實其在肝炎[9]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10]、肺炎[11]及慢性疾病[12]中表現(xiàn)出一定的抗炎活性。但關(guān)于TFs在骨關(guān)節(jié)炎癥中的抗炎活性及機制研究尚未見報道。由于OA疾病產(chǎn)生的原因包括促炎因子引起的軟骨細胞功能障礙及其產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)[13]，因此，探究TFs的抗炎機制可為防治骨關(guān)節(jié)炎疾病提供一定的理論基礎(chǔ)。本實驗采用IL-1β誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的正常大鼠軟骨細胞，構(gòu)建OA炎性退變細胞模型，首次研究茶黃素在軟骨細胞合成及分解代謝中對ECM穩(wěn)態(tài)的保護作用及抗炎功效，為其對骨關(guān)節(jié)炎防治作用的研究提供理論參考。

圖14 種主要茶黃素單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1Chemical structures of four theaflavin monomers

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶黃素，來源于紅茶提取物，純度80%，貨號T5550，購自美國Sigma公司；重組大鼠IL-1β購自英國Peprotech公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、雙抗溶液(青霉素/鏈霉素)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)和DEME/F 12培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；抗熒光淬滅封片液和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）細胞染色液均購自上海碧云天公司；Ⅱ型膠原（typeⅡcollagen, ColⅡ）抗體購自美國Santa Cruz公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinases-13,MMP-13）抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的抗兔和抗小鼠IgG抗體均購自美國CST公司；山羊抗兔Dylight 488熒光二抗購自美國Abcam公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR?Green Supermix試劑盒購自美國Bio-Rad公司；ReverTra Ace?購自日本ToYoBo公司；熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)引物購自上海生物工程技術(shù)有限公司。

實驗動物采用清潔級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體質(zhì)量120～150 g，來源于浙江省實驗動物中心。所有動物實驗的操作均經(jīng)過浙江大學(xué)動物中心倫理委員會批準。

1.2 儀器與設(shè)備

JB-CJ-1FX超凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；Galaxy系列二氧化碳培養(yǎng)箱（英國RS Biotech公司）；Nikon倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Western blot電泳轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad公司）；NanoDrop蛋白核酸定量儀（美國NanoDrop公司）；480Ⅱ熒光定量PCR儀（美國Roche公司）；G:BOX化學(xué)發(fā)光成像儀（英國Syngene公司）。

1.3 方法

1.3.1 軟骨細胞分離、培養(yǎng)及傳代

用6 mg/mL戊巴比妥鈉對SD大鼠麻醉致死后，將其浸泡于75%乙醇10 min。在無菌條件下打開膝關(guān)節(jié)，分離關(guān)節(jié)軟骨面，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，用滅菌手術(shù)刀削下軟骨碎片，剪碎轉(zhuǎn)移至含有2 mL 0.2%膠原酶的6 cm培養(yǎng)皿中消化；30 min后，在原6 cm培養(yǎng)皿中補加3 mL完全培養(yǎng)基（含10%FBS及1%青、鏈霉素），轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)；24 h后，將組織懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，1.2萬r/min離心5 min后棄上清液，用完全培養(yǎng)基將細胞吹打均勻，接種至原培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。待細胞貼壁長滿至80%～90%后進行傳代，期間每隔2 d進行細胞換液，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.3.2 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞

取大鼠第1代軟骨細胞，胰酶消化后以2×104個/孔細胞密度接種到鋪有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)細胞爬片24 h。取出制備好的第2代細胞爬片，用95%乙醇固定20 min，PBS漂洗3次，用體積分數(shù)為1%的甲苯胺藍乙醇液染色20 min，PBS清洗2次，無水乙醇漂洗，在空氣中干燥后用中性樹膠封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3ColⅡ免疫熒光染色鑒定軟骨細胞

細胞爬片的制備方法同上。取出已制備好的細胞爬片進行免疫細胞熒光染色。具體步驟如下：用PBS-BSA[用PBS配制1%牛血清白蛋白（bovine serum albumine,BSA）]孵育細胞15 min，PBS漂洗2次，在4%多聚甲醛中固定細胞20 min；棄液體，PBS漂洗3次，用0.2%Triton-X-100通透細胞10 min；PBS漂洗3次，PBS-BSA孵育15 min；PBS漂洗2次，ColⅡ抗體4℃孵育過夜；次日，PBS漂洗3次，用PBS-BSA孵育15 min；PBS漂洗2次，加入山羊抗兔Dylight 488熒光二抗孵育1 h；PBS清洗3次后，用DAPI染色30 min；滴入防淬滅劑，封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 實驗分組

待第1代細胞貼壁長滿至80%～90%時，經(jīng)胰酶消化重懸后接種至6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。IL-1β按照說明書用0.1%BSA溶解，TFs用PBS溶解稀釋成不同濃度，－20℃避光保存，備用。實驗分為3個處理組：空白組（無干預(yù)無刺激，G0）、模型組（10 ng/mL IL-1β刺激，G1）和TFs干預(yù)組（G2）。待細胞長滿至80%～90%時，干預(yù)組在不同濃度的TFs中預(yù)處理2h后加入終質(zhì)量濃度為10ng/mL的IL-1β，模型組僅加入IL-1β和PBS，對照組加入PBS，各組細胞培養(yǎng)基總體積一致，培養(yǎng)24 h后，收集細胞進一步分析。

1.3.5 細胞活性檢測

采用CCK-8試劑盒測定TFs對SD大鼠軟骨細胞是否有毒性作用[14]。第1代細胞經(jīng)胰酶消化后吹打均勻，以1×104個/孔細胞密度接種至96孔板中培養(yǎng)。待第2代軟骨細胞長滿至80%～90%時，分別加入0、25、50、75、100 μg/mL的TFs干預(yù)24 h，每組設(shè)置5個重復(fù)孔。更換新鮮完全培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，輕輕振蕩混勻后常規(guī)培養(yǎng)2 h。用酶標儀檢測在450 nm波長處的光密度值，以無細胞孔作為空白組，無TFs干預(yù)孔作為對照組。定義對照組（TFs質(zhì)量濃度為0 μg/mL）細胞存活率為100%，其余各實驗組細胞活性按下式計算，確定TFs對細胞的無毒性劑量。

1.3.6 熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)

用Trizol收取各組細胞，抽提軟骨細胞總RNA，并用NanoDrop蛋白核酸定量儀檢測RNA濃度。取1 μg RNA，采用ReverTra Ace?反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA模板，構(gòu)建熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）體系（10 μL）。反應(yīng)條件如下：95℃變性10 s，95℃退火5 s，60℃延伸

30 s，共40個循環(huán)。選用大鼠管家基因GAPDH為內(nèi)參，

將得到的各組CT值按公式2－ΔΔCT計算ColⅡ和蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）的相對表達量。實驗所用引物序列詳見表1。

1.3.7 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準誤表示，統(tǒng)計分析采用Graphpad prism 5軟件的Student-t檢驗處理，并采用雙尾t檢驗進行分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物序列Table 1Primer sequences of target and house-keeping genes used in this experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞形態(tài)觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察可見：分離培養(yǎng)的原代軟骨細胞接種約12h后開始貼壁；4d左右細胞數(shù)目明顯增多，形態(tài)呈圓形或多角形；10d原代細胞融合成片，呈現(xiàn)典型“鋪路石”狀，可進行傳代；傳代約6 h后的細胞開始貼壁，生長速度加快，4d左右即可傳代培養(yǎng)，且細胞周圍可見具有折光性的細胞外基質(zhì)（圖2）。

圖2 在倒置相差顯微鏡下軟骨細胞形態(tài)觀察Fig.2Morphological observation of chondrocytes by inverted phase contrast microscope

2.2 細胞鑒定

軟骨細胞的特征性分泌產(chǎn)物酸性蛋白聚糖與甲苯胺藍堿性染液結(jié)合后呈異染性。在本實驗中，甲苯胺藍染色顯示，培養(yǎng)細胞單層生長，呈多角形，細胞質(zhì)為藍紫色（圖3A）。Ⅱ型膠原（ColⅡ）免疫熒光染色顯示：細胞質(zhì)較疏松，呈綠色；細胞核較大，呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，呈藍色(圖3B)。這表明培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞。

圖3 在倒置熒光顯微鏡下軟骨細胞鑒定觀察Fig.3Identification of chondrocytes by inverted fluorescent microscope

2.3TFs對大鼠軟骨細胞活性的影響

待第2代大鼠軟骨細胞鋪滿至80%～90%時，用0～100 μg/mL TFs干預(yù)細胞24 h，測定TFs對軟骨細胞活力的影響，篩選TFs的安全劑量閾值。結(jié)果（圖4）表明：與對照組（TFs質(zhì)量濃度為0 μg/mL）相比，25、50、75 μg/mL TFs干預(yù)組的細胞存活率間在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（P＞0.05）；100 μg/mL TFs干預(yù)組的細胞存活率下降，且與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明0～75 μg/mL TFs是安全無毒的，不影響軟骨細胞活力。因此，后續(xù)研究選用25、50、75 μg/mL這3個劑量的TFs，以保證細胞處于良好的狀態(tài)。

圖4TFs對大鼠軟骨細胞活性的影響Fig.4Effect of TFs on cell viability of rat chondrocytes

2.4TFs對IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細胞合成因子活性的影響

提取軟骨細胞總RNA，通過qRT-PCR技術(shù)檢測TFs對炎癥軟骨細胞中合成因子活性的影響。如圖5所示：IL-1β處理細胞24 h后，ColⅡ和ACAN的表達量均極顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)TFs（25、50、75 μg/mL）干預(yù)后，軟骨細胞中ColⅡ和ACAN mRNA表達量明顯高于模型組（P＜0.05），并有效抑制了IL-1β引起的合成因子活性的降低，且隨著TFs濃度的增加，其抑制效果呈濃度依賴性變化。說明TFs通過增強軟骨細胞合成因子ColⅡ和ACAN活性來抑制軟骨基質(zhì)降解。

圖5TFs對IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細胞合成因子活性的影響Fig.5Effects of TFs on anabolic activity of IL-1β-induced rat chondrocytes

2.5TFs對IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細胞分解因子活性的影響

MMP-13主要參與關(guān)節(jié)軟骨分解代謝，是目前在破壞軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)研究中受到關(guān)注較多的降解酶指標[15]。本實驗測定了茶黃素復(fù)合物對該因子mRNA表達量的影響。如圖6所示：與空白對照組相比，IL-1β處理大鼠軟骨細胞24 h后，MMP-13 mRNA表達量極顯著增加（P＜0.001）；與模型組相比，軟骨細胞預(yù)孵不同質(zhì)量濃度的TFs（25、50、75 μg/mL）2 h，再加入IL-1β（10 ng/mL）共培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)MMP-13的表達水平呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性降低（P＜0.05）。由此可見，TFs可減弱軟骨細胞分解因子MMP-13活性，抑制軟骨基質(zhì)的降解，維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

2.6TFs對IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細胞COX-2 mRNA表達的影響

圖6TFs對IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細胞分解因子活性的影響Fig.6Effect of TFs on catabolic activity of IL-1β-induced rat chondrocytes

OA在病變過程中會釋放出大量的炎癥因子，其中前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是參與該病變的主要介質(zhì)，因此，其合成所需的關(guān)鍵酶環(huán)氧化酶（cyclooxygenase-2,COX-2）對于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用和影響[16]。在本研究中IL-1β處理大鼠軟骨細胞24 h后的COX-2 mRNA表達量呈極顯著增加（P＜0.001）；與模型組相比，軟骨細胞在不同質(zhì)量濃度的TFs（25、50、75 μg/mL）中預(yù)孵2 h再加入IL-1β（10 ng/mL）共培養(yǎng)24 h后，COX-2的表達水平明顯受到抑制（P＜0.05），且抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴性（圖7）。

圖7TFs對IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細胞環(huán)氧化酶（COX-2）蛋白表達的影響Fig.7Effect of TFs on cyclooxygenase-2(COX-2)expression of IL-1β-induced rat chondrocytes

2.7TFs對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞IL-1β mRNA表達的影響

如圖8所示：正常大鼠軟骨細胞經(jīng)IL-1β處理24 h后，炎癥因子IL-1β mRNA表達水平極顯著升高（P＜0.01）；在TFs(25、50、75 μg/mL)中預(yù)孵2h后再加入IL-1β共培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)IL-1β表達水平呈濃度依賴性降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8TFs對IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細胞IL-1β mRNA表達的影響Fig.8Effect of TFs on IL-1β mRNA expression of IL-1β-induced rat chondrocytes

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率正在迅速增加，可能在今后幾十年內(nèi)成為世界上第四大致畸原因[17]。關(guān)節(jié)軟骨的破損與退化是OA的主要病理變化。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細胞及其分泌的細胞外基質(zhì)構(gòu)成，在成人的正常關(guān)節(jié)軟骨中，軟骨細胞僅占軟骨總體積的2%，其余為細胞外基質(zhì)，主要由膠原(Ⅱ型膠原占80%～90%[18])和蛋白聚糖組成，其中，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖是軟骨細胞的特異性分泌產(chǎn)物，常用于軟骨細胞鑒定。本實驗培養(yǎng)的細胞經(jīng)甲苯胺藍染色呈異染性，Ⅱ型膠原免疫熒光染色呈陽性，表明分離培養(yǎng)的細胞是軟骨細胞。

茶黃素是紅茶的有效活性成分之一，其分子結(jié)構(gòu)包含多個酚羥基及沒食子酰基，研究已證實其在肝、肺等人體器官炎癥中表現(xiàn)出豐富的抗炎活性[9-12]。CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果顯示，0～75 μg/mL的TFs是安全無毒的，不影響軟骨細胞活力。因此，本研究采用質(zhì)量濃度為25、50、75 μg/mL茶黃素來評估其對骨關(guān)節(jié)炎炎癥的調(diào)節(jié)功效及分子機制。

Ⅱ型膠原（ColⅡ）和蛋白聚糖（ACAN）是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的主要組成成分，其主要功能是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）的合成和分解，維持關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠軟骨細胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后，ColⅡ及ACAN含量明顯降低，與ZHAO等[19]的研究結(jié)果一致。此外還發(fā)現(xiàn)，炎癥軟骨細胞經(jīng)TFs預(yù)干預(yù)后，其ColⅡ和ACAN mRNA的表達明顯上調(diào)，改善了軟骨基質(zhì)合成受阻現(xiàn)象。MMP-13在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變中扮演了十分重要的角色，它可以通過降解關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)成分，破壞合成和分解代謝的動態(tài)平衡。CHEN等[20]發(fā)現(xiàn)，兔軟骨細胞經(jīng)IL-1β刺激24 h后，其MMP-13 mRNA的表達量極顯著增加，本實驗研究結(jié)果與此相符。在此基礎(chǔ)上，添加TFs藥物預(yù)干擾能夠顯著降低MMP-13降解酶的蛋白表達量，可有效抑制軟骨基質(zhì)的降解現(xiàn)象。

大量研究表明，IL-1β可以調(diào)節(jié)軟骨細胞ECM的更新周轉(zhuǎn)率，引起ECM合成和分解代謝失衡[19-22]。同時，處于基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡環(huán)境下的軟骨細胞又將促進包括其自身在內(nèi)的炎性因子及炎癥介質(zhì)（如COX-2 mRNA）的大量合成和釋放，進而對炎癥反應(yīng)產(chǎn)生自行性推進的影響，加大OA發(fā)展進程。因此，控制軟骨細胞的炎癥反應(yīng)有利于控制或延緩OA進展，并可能成為治療OA的關(guān)鍵。在本研究中，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞的IL-1β和COX-2 mRNA的表達量顯著增加，與陳文超等[23]報道的結(jié)果相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，TFs抑制IL-1β和COX-2 mRNA的表達呈濃度依賴性，其抗炎作用體現(xiàn)了多靶點性。以上結(jié)果表明，TFs對軟骨細胞炎癥因子IL-1β和炎癥介質(zhì)COX-2的表達具有抑制作用。

綜上所述，茶黃素作為紅茶的重要組成部分及營養(yǎng)物質(zhì)，可通過上調(diào)軟骨細胞合成因子ColⅡ和ACAN mRNA的表達，并下調(diào)分解因子MMP-13 mRNA的表達，來抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨基質(zhì)的降解；同時，通過降低炎癥因子IL-1β和炎癥誘導(dǎo)酶COX-2 mRNA的表達水平，抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果表明，TFs可以在一定程度上延緩大鼠軟骨細胞炎性退變，正向調(diào)控OA病理進程。

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ZHOU Ying1?,HUANG Qian2?,WANG Shuai2,CHEN Ping1*(1.Department of Tea Science,College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.School of Basic Medical Sciences,Zhejiang University, Hangzhou 310058,China)

theaflavins;osteoarthritis;chondrocyte;interleukin-1β;cyclooxygenase-2;inflammatory degeneration

S 571.1;R 684.3;R 392.12

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.12.282

國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-23）。

*通信作者(Corresponding author):陳萍(http://orcid.org/0000-0001-7995-6168),E-mail:pingchen@zju.edu.cn

周盈(http://orcid.org/0000-0002-4231-3270),E-mail:vaelailai@foxmail.com。?共同

第一作者

2016-12-28；接受日期(Accepted):2017-02-16