Cu2+、Zn2+對西藏不同區域野生賴草萌發特性和生理效應的影響

徐雅梅， 張衛紅， 藺永和， 劉大林， 苗彥軍*

(1. 西藏農牧學院， 西藏 林芝 86000； 2. 揚州大學動物科學與技術學院， 江蘇 揚州225009; 3. 蘭州大學， 甘肅 蘭州 730000)

西藏位于我國西南邊陲，作為青藏高原的主體，具有“世界第三極”之稱。該區域具有豐富的礦產資源，然而礦產開采過程中，礦區及周邊土壤往往會受到Cu、Zn、Pb、Cd等重金屬不同程度的污染[1-3]，加之設施農業發展過程中化肥、農藥的大量施用[4]及交通排放[5-6]等因素致使土壤遭到Cu、Zn等重金屬的污染[7]。土壤系統中的重金屬污染和防治一直是國際上研究的難點和熱點[8]，尤其是受青藏高原獨特環境的影響，生態系統十分脆弱，一經破壞，不易恢復[9]。因此，對礦跡地和重金屬污染區進行恢復治理刻不容緩，而進行重金屬污染土壤恢復治理的一個重要途徑是選育具有優良抗性的植物[10]。

賴草(Leymussecalinus)屬于禾本科多年生草本植物，主要分布于我國華北、東北、西北和西南地區[11]；具有廣泛適應性和較高的抗逆性，能夠適應青藏高原嚴酷的生存環境，是當地的重要優勢鄉土植物之一[12]。賴草具有強壯的根莖和迅速的分蘗繁殖能力，其在生態恢復過程中易形成單優群落[13]；此外，賴草還具有適口性好、營養價值高和易被家畜所喜食等諸多優良特性，是重要的牧草資源[14]。目前，國內外關于賴草耐旱、耐寒及耐鹽堿等抗逆性研究方面做了大量工作[12,15-16]，但關于賴草在重金屬脅迫下的響應研究并不多見，尤其是關于西藏不同區域野生賴草種子資源抗重金屬離子脅迫的研究還未見詳細報道。因此，本研究以采自西藏4個不同區域的賴草作為試驗材料，通過觀測不同濃度的重金屬離子(Cu2+、Zn2+)處理下各賴草種子萌發、生長狀況及生理指標的變化，以期為賴草在西藏重金屬污染地治理中的運用和西藏賴草種子資源的評價與利用提供科學參考依據。

1 試驗設計

1.1 試驗材料

供試材料為采集于西藏4個不同區域的賴草種子，其編號和生境情況如表1所示，供試試劑為CuSO4·5H2O和ZnSO4·7H2O(分析純)。

表1 試驗種子編號及生境Table 1 Test seed code and habitat

1.2 試驗方法

選取籽粒均勻飽滿一致的4種賴草種子，用0.1%的高錳酸鉀溶液消毒15 min，接著用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸干種子表面水分，接著在蒸餾水中浸泡8 h，使種子充分吸水。然后在發芽盒中放置2層濾紙，用蒸餾水做對照，每個發芽盒中分別用膠頭滴管加Cu2+和Zn2+濃度分別為20，50，100，200，300，400，500 mg·L-1的CuSO4溶液和ZnSO4溶液至濾紙飽和(形成一層水膜)為止，然后將浸泡好的種子均勻擺置到發芽盒中，每種賴草種子100粒，每個重金屬離子濃度梯度設置5個重復。從第二天開始，每日9:30和21:30用膠頭滴管分別加對應溶液至濾紙飽和，使重金屬離子濃度保持基本一致。

1.3 測定指標及方法

1.3.1萌發指標的測定 從第2 d開始，每天記錄各處理下賴草種子萌發數，到第7 d時，以胚根露出種皮為萌發標志[17]，統計發芽勢(Gp)。發芽試驗結束時(14 d)統計發芽率(Gr)，測定胚芽長和胚根長，每個處理測5株；并將胚根、胚芽分開，用電子天平(精確到0.0001)稱量胚根、胚芽鮮重，計算各處理下的相對發芽勢、相對發芽率、活力指數。計算公式如下[18-19]：

① 發芽勢(Gp)=前7 d累計發芽種子數/供試種子總數×100%

發芽率(Gr)=試驗結束累計發芽種子數/供試種子總數×100%

② 發芽指數(GI)=處理后t日的發芽數/相應的發芽時間。

③ 根系耐受指數=(某濃度下的胚根長/對照處理的胚根長)×100%

④ 活力指數(V)=發芽指數×生物量(生物量=胚芽鮮重+胚根鮮重)。

1.3.2生理指標的測定 采用硫代巴比妥酸法[20]測定胚芽中丙二醛(MDA)的含量。

1.4 數據分析

采用Excel 2013對試驗數據預處理后；再用SPSS 19.0進行方差分析，Duncan法進行多重比較；Excel 2013作圖。

2 結果與分析

2.1 Cu2+、Zn2+對賴草發芽勢的影響

由圖1可知，不同重金屬(Cu2+、Zn2+)對采自西藏4個不同地域的賴草發芽勢的影響不同，同種重金屬不同濃度對其發芽勢的影響也不相同。其中LZ 1和TJ 4的發芽勢隨著Cu2+濃度的增加而減小；而LS 2和DZ 3的發芽勢則均表現出先增大后減小的變化趨勢，兩者均在Cu2+濃度為20 mg·L-1時達到試驗組最大值，依次為75.5%和44.71%，當Cu2+濃度超過20 mg·L-1時，發芽勢隨著Cu2+濃度的增大而顯著減小(P< 0.05)。當Cu2+濃度為100 mg·L-1時，TJ 4的發芽勢為0，Cu2+濃度為200 mg·L-1時，4個賴草的發芽勢均為0。

Zn2+處理下，各賴草的發芽勢均表現出低濃度促進，高濃度抑制的變化規律(圖1)。LZ 1和LS 2在Zn2+濃度20 mg·L-1時發芽勢均最高，依次為25.24%和72.67%；當Zn2+濃度超過20 mg·L-1之后，其發芽勢隨著Zn2+濃度的增大而減小。DZ 3和TJ 4在Zn2+濃度為100 mg·L-1時發芽勢均達最高值，依次為43.28%和13.89%，當Zn2+濃度超過100 mg·L-1之后，發芽勢隨著Zn2+濃度的增大而減小。在同一濃度重金屬離子(Cu2+、Zn2+)處理下，采自不同地方的賴草發芽勢之間也表現出顯著性差異(P< 0.05)。

圖1 Cu2+、Zn2+對賴草發芽勢的影響Fig. 1 Effect of Cu2+ and Zn2+ on the germination potential of Leymus secalinus注：圖中不同大寫字母表示同一金屬濃度下不同來源賴草之間存在顯著性差異(P<0.05)；不同小寫字母表示同種賴草在不同金屬濃度之間存在顯著性差異(P < 0.05)，下同Note: Different capital letters indicate significant difference between the same metal concentration under different secalinus (P<0.05); different lowercase letters indicate significant differences between different metal concentrations of the same secalinus (P < 0.05); the same below

2.2 Cu2+、Zn2+對賴草發芽率的影響

由圖2可知，不同濃度Cu2+處理下，LZ 1和TJ 4的發芽率隨著Cu2+濃度的增大而降低，說明試驗濃度下Cu2+對這兩種賴草的萌發具有抑制作用；而LS 2和DZ 3的發芽率隨著Cu2+濃度的增大呈現先上升后下降的變化趨勢，均在Cu2+濃度20 mg·L-1時發芽率最高，依次為86%和48.4%；Cu2+濃度超過20 mg·L-1時，發芽率呈現下降趨勢，且低于對照組發芽率。說明20 mg·L-1Cu2+濃度對LS 2和DZ 3的萌發具有促進作用，而Cu2+濃度超過20 mg·L-1時對這兩種賴草萌發表現出抑制作用。

Zn2+處理下，各賴草發芽率均隨著Zn2+濃度的增大呈先增高后降低的變化趨勢(圖2)。其中LZ 1和LS 2的發芽率均在Zn2+濃度50 mg·L-1時達到實驗組最大值，依次為53.89%和87.42%，均高于對照組和Zn2+濃度20 mg·L-1時的發芽率；當Zn2+濃度大于等于100 mg·L-1時，發芽率迅速降低。表明Zn2+濃度低于50 mg·L-1時對發芽率具有促進作用，而Zn2+濃度大于等于100 mg·L-1時，則對其發芽率具有抑制作用。DZ 3和TJ 4在Zn2+濃度20 mg·L-1時的發芽率最高，超過20 mg·L-1時逐漸降低。但DZ 3的發芽率在Zn2+濃度200 mg·L-1時，仍顯著高于對照組(P<0.05)，Zn2+濃度達到300 mg·L-1時才低于對照。表明200 mg·L-1Zn2+濃度對賴草的發芽率具有促進作用，Zn2+濃度≥300 mg·L-1時表現為抑制作用。TJ 4的發芽率直至Zn2+濃度500 mg·L-1時仍高于對照，說明Zn2+濃度在20～500 mg·L-1之間均對其發芽率具有促進作用。

圖2 Cu2+、Zn2+對賴草發芽率的影響Fig.2 Effect of Cu2+ and Zn2+ on the germination rate of Leymus secalinus

2.3 Cu2+、Zn2+對賴草發芽指數的影響

不同濃度的重金屬離子(Cu2+、Zn2+)對采自西藏4個不同地域賴草的發芽指數有不同的影響，整體表現為低濃度提高其發芽指數，高濃度降低其發芽指數(圖3)。Cu2+處理下，LZ 1和TJ 4的發芽指數隨著Cu2+濃度的升高而降低，而LS 2和DZ 3的發芽指數隨著Cu2+濃度的升高呈先增大，在Cu2+濃度為20 mg·L-1時達到最大值，當Cu2+濃度超過20 mg·L-1時呈現下降趨勢。隨Zn2+濃度增加，各賴草發芽指數均表現為先增大后減小的變化趨勢，其中LZ 1和LS 2在Zn2+濃度為50 mg·L-1時發芽指數最高，DZ 3和TJ 4在Zn2+濃度為20 mg·L-1時發芽指數最高，此后發芽指數隨著Zn2+濃度增大而降低。

圖3 Cu2+、Zn2+對賴草發芽指數的影響Fig.3 Effect of Cu2+ and Zn2+ on the germination index of Leymus secalinus

2.4 Cu2+、Zn2+對賴草胚芽的影響

2.4.1Cu2+、Zn2+對賴草胚芽長度的影響 由圖4可知，不同濃度Cu2+處理下，LZ 1和TJ 4的胚芽長度均隨著Cu2+濃度的增大而減少；LS 2和DZ 3的胚芽長隨著Cu2+濃度的增大呈現先減少后增高的變化趨勢，Cu2+濃度由0 mg·L-1增加至50 mg·L-1的時，胚芽長度隨著Cu2+濃度的增大而降低，表現出同LZ 1和TJ 4相同的變化規律，而Cu2+濃度為100 mg·L-1時，LS 2和DZ 3的胚芽長度稍微有所增加，但差異不顯著。不同濃度Zn2+處理下，4個賴草的胚芽長度整體上呈先增大后減小的變化趨勢，但有些賴草在某些濃度上有所差別。其中Zn2+濃度為20 mg·L-1時，各賴草胚芽長度均大于其他處理下的胚芽長度；Zn2+濃度由20 mg·L-1增加到200 mg·L-1的過程中，DZ 3和TJ 4的胚芽長度隨Zn2+濃度的增大而降低；300 mg·L-1Zn2+濃度處理下的胚芽較200 mg·L-1的胚芽長度有所增加；Zn2+濃度超過300 mg·L-1時，胚芽長度又呈現遞減趨勢。LZ 1和LS 2的胚芽長度由20 mg·L-1增加到400 mg·L-1的過程中呈遞減變化趨勢，但500 mg·L-1Zn2+濃度下較400 mg·L-1時的胚芽長度卻稍有所增加。

圖4 Cu2+、Zn2+對賴草胚芽長的影響Fig.4 Effect of Cu2+ and Zn2+ on germ length of Leymus secalinus

2.4.2Cu2+、Zn2+對賴草胚芽鮮重的影響 由圖5可知，Cu2+處理下，4個賴草的胚芽鮮重整體上均隨著Cu2+濃度的升高而降低。LS 2和DZ 3在Cu2+濃度為100 mg·L-1時的胚芽鮮重較50 mg·L-1有所增加，但仍小于20 mg·L-1時的胚芽鮮重。Zn2+處理下，4個賴草的胚芽鮮重整體上均呈先增大后減小的變化規律。其中Zn2+濃度50 mg·L-1時，LS 2的胚芽鮮重大于其他濃度處理下的胚芽鮮重，為0.1136 g，表明該濃度對LS 2胚芽生長的促進作用最強；而其他3個賴草均在Zn2+濃度為20 mg·L-1時就達到試驗組最大值。

圖5 Cu2+、Zn2+對賴草胚芽鮮重的影響Fig.5 Effect of Cu2+ and Zn2+ on the germ fresh weight of Leymus secalinus

2.5 Cu2+、Zn2+對賴草胚根的影響

2.5.1Cu2+、Zn2+對賴草胚根長度的影響 由圖6可知，Cu2+處理下，4種賴草的胚根長均隨著Cu2+濃度的升高而降低；Cu2+濃度越大，胚根越短，說明Cu2+對4種賴草的胚根伸長具有抑制作用，且不同濃度Cu2+處理間4種賴草的胚根長存在顯著差異(P< 0.05)。Zn2+處理下，LZ 1的胚根長隨著Zn2+濃度的增加呈現遞減的變化規律；其他3種賴草的胚根長整體上隨著Zn2+濃度的增加呈先增大后減小的變化趨勢， Zn2+濃度為20 mg·L-1時其胚根長度均達到試驗組最大值，說明該濃度對胚根長度具有促進作用；當Zn2+濃度高于50 mg·L-1時則表現出明顯的抑制作用。同時，同種金屬相同濃度處理下，不同來源賴草的胚根長度對該濃度重金屬脅迫表現出不同的響應，且存在顯著性差異(P< 0.05)。

圖6 Cu2+、Zn2+對賴草胚根長度的影響Fig.6 Effect of Cu2+ and Zn2+ on radicle length of Leymus secalinus

2.5.2Cu2+、Zn2+對賴草胚根鮮重的影響 由圖7可知，Cu2+處理下，胚根鮮重隨著Cu2+濃度的增大而降低，說明此時Cu2+對各賴草的胚根鮮重具有明顯的抑制作用。Cu2+濃度由0 mg·L-1增加到20 mg·L-1時各賴草胚根鮮重迅速降低，Cu2+濃度為20～100 mg·L-1時，各賴草的胚根鮮重變化幅度則相對較小。不同濃度Zn2+處理下，各賴草的胚根鮮重整體上呈先增后減的變化趨勢。Zn2+濃度為0～50 mg·L-1時各賴草胚根鮮重變化差異不顯著，當Zn2+濃度為100 mg·L-1時，各賴草胚根鮮重量迅速降低，說明該濃度處理下各賴草的胚根鮮重具有明顯的抑制作用。當Zn2+濃度超過100 mg·L-1之后，各賴草的胚根鮮重呈現緩慢的變化幅度。說明此濃度階段的Zn2+對各賴草的胚根鮮重具有一定的抑制作用，但差異不顯著。

圖7 Cu2+、Zn2+對賴草胚根鮮重的影響Fig.7 Effect of Cu2+ and Zn2+ on radicle fresh weight of Leymus secalinus

2.6 Cu2+、Zn2+對賴草根系耐受指數的影響

由圖8可知，不同濃度Cu2+處理下，4個賴草的根系耐受指數隨著Cu2+濃度增大而降低。不同濃度Zn2+處理下，LZ 1和LS 2的根系耐受指數均隨著Zn2+濃度增大而降低，但DZ 3和TJ 4的耐受性指數先增大，當Zn2+濃度為20 mg·L-1時達到最高值，此后，兩種賴草的根系耐受指數隨著Zn2+濃度增大而降低，Zn2+濃度越大，根系耐受指數越低。由此可見，Cu2+和Zn2+對4個賴草根系耐受指數具有不同的影響，同種金屬同濃度溶液對不同來源賴草的影響也不同。

圖8 Cu2+、Zn2+對賴草根系耐受指數的影響Fig.8 Effect of Cu2+ and Zn2+ on root tolerance index of Leymus secalinus

2.7 Cu2+、Zn2+對賴草種子活力指數的影響

由圖9可知，不同濃度Cu2+處理下，DZ 3的種子活力指數先升高后降低，在Cu2+濃度為20 mg·L-1時達到最大值；其他3種賴草的種子活力指數均隨著Cu2+濃度的增大而減小。LS 2的種子活力指數下降幅度最大，基本呈直線下降。不同濃度Zn2+處理下，4種賴草的種子活力指數隨Zn2+濃度增加均呈先增大后減小的變化趨勢，表明低濃度Zn2+提高種子活力指數，高濃度Zn2+降低種子活力指數。其中LZ 1和LS 2的活力指數在Zn2+濃度為50 mg·L-1時達到最大值，而DZ 3和TJ 4在Zn2+濃度為20 mg·L-1時就達到最大值，表明不同種賴草對Zn2+的耐受性不同。

圖9 Cu2+、Zn2+對賴草種子活力指數的影響Fig.9 Effect of Cu2+ and Zn2+ on seed vigor index of Leymus secalinus

2.8 Cu2+、Zn2+對賴草丙二醛(MDA)含量的影響

4種賴草的丙二醛(MDA)含量均隨重金屬離子(Cu2+、Zn2+)濃度的增大而增加，重金屬離子濃度越大，MDA含量越高；表明重金屬離子均對賴草胚芽細胞膜具有破壞作用，重金屬濃度越大，破壞作用越強。在同濃度的重金屬離子處理下，采自不同地區賴草的MDA含量不同，LZ 1的MDA含量變化幅度最大，Cu2+處理下增加了437.6 nmol·g-1，Zn2+處理下增加了597.9 nmol·g-1。LS 2的變化幅度最小，在Cu2+、Zn2+處理下分別增加了39.4 nmol·g-1和86.0 nmol·g-1。

圖10 Cu2+、Zn2+對賴草丙二醛含量的影響Fig.10 Effect of Cu2+ and Zn2+ on the MDA content of Leymus secalinus

3 討論

發芽勢、發芽率、發芽指數和種子活力不僅與牧草本身的生物學特性有關，而且與種子所處的生境具有密不可分的關系，是反映牧草出苗速率和出苗整齊度的重要指標[21-22]。賴草種子出苗率低或出苗不整齊，將導致作物大幅度減產或達不到重金屬污染治理的效果[23]。研究過程中發現，Cu2+處理下，LS 2和DZ 3的發芽勢、發芽率、發芽指數均呈先增大后減小的趨勢，說明低濃度的Cu2+對這兩種賴草種子的萌發具有促進作用；而高濃度Cu2+則表現出抑制作用，該結果與銅脅迫下黑麥草(Loliummultiflorum)[24]變化規律基本一致。LZ 1和TJ 4的發芽勢、發芽率、發芽指數均隨Cu2+濃度的增大而減小，說明本試驗組濃度對這兩種賴草只表現為抑制作用，未表現出低濃度促進萌發，高濃度抑制萌發的變化效應，該結果與銅脅迫下高羊茅(Festucaarundinacea)[24]和油菜(Brassicacampestris)[25]的變化規律一致。由此可以看出采自不同地域的野生賴草對Cu2+的耐性不同。

各賴草種子活力指數隨Cu2+濃度的增大而減小，其主要原因是Cu2+處理下各賴草的胚芽、胚根鮮重均隨Cu2+濃度的增大而減小，故此導致各賴草的種子活力指數呈由大到小的變化規律，這在本研究中得到驗證，該結果與毛竹(Phyllostachysheterocycla)種子在Cu2+脅迫下的萌發特性相同[26]。胚芽、胚根的長度和鮮重及根系耐受指數的變化直接反映不同濃度重金屬處理下賴草幼苗生長規律[27]。研究發現，Cu2+處理下各賴草的胚芽、胚根的長度和鮮重及根系耐受指數均隨著Cu2+濃度的增大而減小，其中胚根長度和鮮重的減小幅度均大于胚芽，其原因可能是胚根是最早與Cu2+溶液直接接觸的部位，受迫時間長，從而致使胚根受損[28]；或者重金屬離子抑制根尖細胞進行有絲分裂，致使根系生長發育受阻[29]。而胚芽未直接與重金屬直接接觸，故此對胚根的抑制作用大于胚芽，這與陳偉等[30]對Cu2+脅迫下4種草坪草種子萌發期胚根、胚芽變化的研究結果一致。

Zn2+處理下，各賴草種子萌發和幼苗生長的各項指標均表現“低濃度的促進作用和高濃度的抑制作用”[19]。表明低濃度Zn2+對各賴草萌發期的生長發育具有促進作用，但濃度較高時，表現出明顯的抑制作用，其原因可能是高濃度的Zn2+對各賴草產生毒害作用，從而抑制了種子的萌發和幼苗的生長[31]。賴草種子發芽率的高低決定了其在重金屬污染土壤恢復治理中的利用價值，研究發現，Zn2+濃度為20 mg·L-1時對各賴草的萌發和幼苗生長各指標均有促進作用，因此可采用該濃度的ZnSO4溶液浸種，以提高種子活力。研究中還發現，LS 2種子活力指數在Zn2+濃度為50 mg·L-1時達到試驗組所有種子活力的最大值，且在Zn2+各濃度處理下活力指數也均較高，Cu2+處理下也是LS 2的種子活力最強，因此可以對LS 2進行馴化選育，以便作為Zn2+污染土壤恢復治理的選擇材料。

MDA是植物膜脂過氧化的終產物之一，其在植物體內的積累會對膜和細胞進一步造成傷害，MDA含量的高低可以反映該植物在不同濃度重金屬離子脅迫下受到的傷害程度[32]。為了探究重金屬離子是否會對植物產生毒害作用，本試驗分別測定了重金屬離子(Cu2+、Zn2+)處理下各賴草胚芽中的MDA含量。研究發現各賴草胚芽中MDA含量隨重金屬離子濃度的升高而增大，低濃度時MDA含量變化差異不顯著，而高濃度時表現出顯著性差異(P<0.05)。由此可見，無論重金屬離子濃度的高低，都會對賴草產生一定的不利影響，重金屬濃度越大，破壞作用越強。

本次試驗還發現采自西藏4個不同地域野生賴草在同種金屬同種濃度處理下的表現性狀也有所差異。其原因可能是野生賴草在長期適應生境的過程中產生變異或者由于生境的不同從而導致遺產背景的不同[33]，故同種金屬同濃度處理下采集不同地域的賴草各指標間存在差異性。

據報道，脫落酸是限制賴草屬牧草萌發和生長的一種重要激素[34]，研究發現，相同處理下，LS2的發芽率高于TJ4，其原因可能是LS2采集于拉薩河邊的沙地，水熱條件充足，在長期適應該環境的過程中，由于逆境脅迫小，因此脫落酸含量減少，發芽率高。而TJ 4采集于塔吉鄉田間地埂上，人為和各種外界影響因素較大，因此賴草通過增加脫落酸含量，降低發芽率來適應不利的生境。但易津等研究證明，隨著賴草屬種子貯存年限的增加，脫落酸含量逐漸降低，種子發芽率隨之逐漸提高[35]，試驗材料LS 2和DZ 3是2011年收獲的種子，LZ 1是2012年采集的，TJ 4是2013年采集的，這也符合上述理論的表述，至于具體原因尚待進一步研究。研究還發現低濃度的重金屬離子對賴草的各項指標均有促進作用，其原因可能是，Cu2+和Zn2+均是植物生長的必須元素，低濃度的重金屬給賴草的萌發提供了一個有利環境，抑制了種子萌發和幼苗生長過程中脫落酸的合成，促進了賴草種子萌發和幼苗生長。

4 結論

重金屬Zn2+處理下，各賴草種子萌發和幼苗生長的各項指標均呈先增大后減小的趨勢，表現出低濃度促進、高濃度抑制效應。重金屬Cu2+處理下，LS 2和DZ 3的發芽勢、發芽率、發芽指數也表現出相同的變化規律；但LZ 1和TJ 4的發芽勢、發芽率、發芽指數及4個野生賴草的幼苗生長指標卻均隨Cu2+濃度的增大而減小。重金屬離子(Cu2+、Zn2+)對胚根的影響大于對胚芽的影響。不同地方的賴草對不同重金屬離子的抗性也不同，對采自于西藏4個不同地方的賴草種子活力指數和MDA含量進行比較，得出LS 2的發芽指標高于其他3個賴草，且對重金屬離子(Cu2+、Zn2+)均具有較強的抗性，可以將其進行選育，以期培育出適合于青藏高原重金屬污染土壤生態恢復的賴草品種。