乳酸菌對苜蓿青貯質量和黃酮含量的影響

姜義寶， 王 洋， 劉振陽， 孫娟娟， 嚴學兵， 玉 柱

(1. 河南農業大學牧醫工程學院， 河南 鄭州 450002； 2. 中國農業科學院草原研究所， 內蒙古 呼和浩特 010010； 3. 中國農業大學動物科技學院， 北京 100193)

紫花苜蓿(Medicagosativa.)是一種優質豆科牧草，富含多種營養成分和黃酮等生物活性物質。乳酸菌是重要的青貯添加劑，可輔助發酵并防止腐敗。乳酸菌在發酵過程中對植物黃酮含量和組分有較大影響，于國萍[1]報道乳酸菌發酵法水解大豆異黃酮可使游離型大豆異黃酮含量增加，苜蓿青貯飼料發酵過程中以及添加乳酸菌對黃酮的影響還未見報道，本研究旨探討在不同青貯時間條件下乳酸菌對苜蓿青貯品質和黃酮含量動態變化的影響，為苜蓿青貯技術開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及添加劑

青貯材料苜蓿為河北涿州實驗基地種植的‘中牧1號’紫花苜蓿，初花期刈割，乳酸菌為中國農業大學青貯實驗室分離出的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，青貯原料化學成分,如表1所示。

1.2 試驗設計

苜蓿青貯原料切短至2 cm左右，經過自然晾曬至含水量為50%，添加乳酸菌1×106CFU·g-1作為試驗組，3個重復，另設一組對照，不添加任何添加劑，原料裝填到青貯瓶中，壓實后蓋上內外蓋，并用膠帶密封，密度為650～680 g·L-1，室溫條件下放置。

表1 苜蓿青貯原料化學成分Table 1 Chemical composition of Medicago sativa ensilage materials

1.3 試驗方法

1.3.1樣品處理 青貯第3，5，7，15，30和60 d打開青貯瓶，取 20 g放入到榨汁機中，加入180 mL純凈水，勻漿2 min后過濾。濾液用來測定pH值、氨態氮(ammonia nitrogen，AN)、乳酸(lactic acid，LA) 、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)。將剩余青貯飼料收集烘干，測定干物質(dry matter，DM)、總氮(total nitrogen，TN)、粗蛋白質(crude protein，CP)，可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fibre，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fibre，ADF)。

1.3.2發酵品質測定 pH值采用雷磁PHSJ-4F測定，氨態氮采用苯酚-次氯酸鈉比色法[2]，計算氨態氮/總氮(ammonia nitrogen/total nitrogen，AN/TN)，水溶性碳水化合物采用蒽酮-硫酸比色法[3]，采用SHIMADZE-10A型高效液相色譜儀測量乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。

1.3.3營養成分及黃酮含量的測量 65℃ 烘箱中烘干 48 h，進行干物質含量測量，采用范氏方法(Van Soest)測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量[4]，粗蛋白采用Tecator 1030型全自動凱氏定氮儀測量。按照薄亞光等[5]方法進行，在分光光度計510 nm處測樣品的吸光度，計算黃酮總含量。

1.4 數據分析

采用Excel 2007整理數據，SPSS 19.0進行數據統計分析，采用T檢驗，以P<0.05為差異顯著性標準，并對兩個變量之間進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 苜蓿青貯過程中pH值、干物質和乳酸含量的變化

由表2可知，在青貯3 d到60 d，添加乳酸菌組干物質含量高于對照組，但差異不顯著。兩組pH值變化較大，在青貯第3 d沒有明顯差異，第5 d到60 d乳酸菌組低于對照組且差異顯著(P<0.05)。乳酸含量隨著青貯時間的延長呈增加趨勢，5 d到60 d乳酸菌組顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 苜蓿青貯過程中pH值、干物質和乳酸含量的變化Table 2 Changes of pH, dry matter and lactic acid contents of alfalfa silage during ensiling

2.2 苜蓿青貯過程中揮發性脂肪酸含量的變化

由表3可知，隨著時間的延長，兩組乙酸含量均呈現增加趨勢，乳酸菌組乙酸含量低于對照組， 7 d到60 d顯著低于對照組(P<0.05)。青貯過程中乳酸菌組丙酸含量除了在青貯15 d高于對照組外，其他時間均低于對照組，并在7 d顯著低于對照組(P<0.05)。青貯3 d和30 d丁酸含量乳酸菌組均低于對照組。乳酸菌組乳酸/乙酸高于對照組，除3 d外，均差異顯著(P<0.05)。

表3 苜蓿青貯過程中揮發性脂肪酸含量的變化Table 3 Changes of volatile fatty acid contents of alfalfa silage during ensiling

2.3 苜蓿青貯過程中氨態氮/總氮及可溶性碳水化合物含量的變化

由表4可知，青貯過程中氨態氮/總氮隨著時間的延長而增加，并且乳酸菌組始終低于對照組(P<0.05)。對照組可溶性碳水化合物在青貯過程中隨著時間的延長呈下降趨勢，乳酸菌組呈先增高后降低變化趨勢，乳酸菌組高于對照組，但差異不顯著。

表4 苜蓿青貯過程中氨態氮/總氮及可溶性碳水化合物含量的變化Table 4 Changes of ammonia nitrogen/total nitrogen and water-soluble carbohydrate contents of alfalfa silages during ensiling

2.4 苜蓿青貯過程中營養成分和黃酮含量的變化

由表5可知，青貯過程中乳酸菌組與對照組相比粗蛋白含量無明顯差異。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量隨著時間的延長呈降低趨勢，并且乳酸菌組酸性洗滌纖維在7 d顯著低于對照組(P<0.05)。青貯過程中乳酸菌組和對照組黃酮含量隨著時間的延長而增加，30 d乳酸菌組黃酮含量高于對照組，并且差異顯著(P<0.05)。

表5 苜蓿青貯過程中營養成分和黃酮含量的變化Table 5 Changes of nutrition and flavonoids contents of alfalfa silage during ensiling

2.5 黃酮與乳酸和pH值的回歸及相關分析

由表6可知，無論是乳酸菌組還是對照組，苜蓿青貯過程中pH值和乳酸含量對黃酮影響很大，兩組中黃酮和pH值呈明顯的負相關(P<0.05)，對照組中黃酮與乳酸含量呈顯著正相關(P<0.05)。

表6 黃酮與乳酸和pH值的回歸分析和相關性分析Table 6 Regression and correlations analysis of flavonoids between lactic acid and pH

3 討論與結論

3.1 乳酸菌對苜蓿青貯過程中發酵品質的影響

青貯發酵過程伴隨著營養物質的改變，試驗苜蓿青貯過程中干物質含量均有下降，添加乳酸菌后干物質含量高于對照組，添加乳酸菌5 d青貯飼料pH值4.77、第7 d為4.08，達到優質青貯飼料的要求。試驗中對照組乙酸含量在后期顯著高于乳酸菌組，乳酸/乙酸含量低于乳酸菌組，表明添加乳酸菌后苜蓿青貯過程中以同型發酵為主時期延長，減少了干物質的損失。丁酸和氨態氮含量是衡量青貯飼料優劣的重要指標[6]。添加乳酸菌后從3 d開始氨態氮/總氮含量顯著低于對照組，表明添加乳酸菌使苜蓿原料草附著的乳酸菌數量增加，形成酸性環境，減少早期植物蛋白酶對含氮化合物的降解作用，降低氨態氮/總氮含量，改善青貯飼料的發酵品質。

3.2 乳酸菌對苜蓿青貯過程中營養成分和黃酮含量的影響

青貯過程中無論對照組還是添加乳酸菌，苜蓿青貯飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量隨著時間的延長呈現降低的趨勢，乳酸菌組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維低于對照組，可能是由于添加乳酸菌改善了發酵條件，增加青貯中有效乳酸菌數量，大量乳酸菌發酵利用了部分纖維而導致青貯苜蓿中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量降低，試驗中乳酸菌組對粗蛋白含量沒有明顯的影響，這與賴玉嬌研究結果相一致[7]。青貯發酵過程中營養成分及物質的變化是一個復雜的化學反應過程，原料所含的各種成分都可能發生變化，黃酮是苜蓿重要的生物活性物質之一，隨著青貯時間的延長，黃酮含量呈現升高的變化趨勢，添加乳酸菌后苜蓿黃酮含量在整個青貯過程中均高于對照組，并在青貯30 d差異顯著，表明添加乳酸菌能夠提高苜蓿中黃酮的含量，原因可能是苜蓿中黃酮類化合物大部分與細胞壁中的木質素結合在一起，青貯過程中可以破壞植物細胞壁，使萃取時細胞內的物質更多釋放出來。

綜上所述，添加乳酸菌改善了苜蓿青貯發酵品質，迅速降低pH值，提高乳酸含量，降低酸性洗滌纖維，增加苜蓿黃酮含量，并且苜蓿青貯過程中黃酮含量與pH值和乳酸呈顯著相關性。