乳酸菌對(duì)苜蓿青貯質(zhì)量和黃酮含量的影響

姜義寶， 王 洋， 劉振陽(yáng)， 孫娟娟， 嚴(yán)學(xué)兵， 玉 柱

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 北京 100193)

紫花苜蓿(Medicagosativa.)是一種優(yōu)質(zhì)豆科牧草，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮等生物活性物質(zhì)。乳酸菌是重要的青貯添加劑，可輔助發(fā)酵并防止腐敗。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)植物黃酮含量和組分有較大影響，于國(guó)萍[1]報(bào)道乳酸菌發(fā)酵法水解大豆異黃酮可使游離型大豆異黃酮含量增加，苜蓿青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中以及添加乳酸菌對(duì)黃酮的影響還未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨探討在不同青貯時(shí)間條件下乳酸菌對(duì)苜蓿青貯品質(zhì)和黃酮含量動(dòng)態(tài)變化的影響，為苜蓿青貯技術(shù)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及添加劑

青貯材料苜蓿為河北涿州實(shí)驗(yàn)基地種植的‘中牧1號(hào)’紫花苜蓿，初花期刈割，乳酸菌為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)青貯實(shí)驗(yàn)室分離出的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，青貯原料化學(xué)成分,如表1所示。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

苜蓿青貯原料切短至2 cm左右，經(jīng)過(guò)自然晾曬至含水量為50%，添加乳酸菌1×106CFU·g-1作為試驗(yàn)組，3個(gè)重復(fù)，另設(shè)一組對(duì)照，不添加任何添加劑，原料裝填到青貯瓶中，壓實(shí)后蓋上內(nèi)外蓋，并用膠帶密封，密度為650～680 g·L-1，室溫條件下放置。

表1 苜蓿青貯原料化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of Medicago sativa ensilage materials

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品處理 青貯第3，5，7，15，30和60 d打開(kāi)青貯瓶，取 20 g放入到榨汁機(jī)中，加入180 mL純凈水，勻漿2 min后過(guò)濾。濾液用來(lái)測(cè)定pH值、氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)、乳酸(lactic acid，LA) 、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)。將剩余青貯飼料收集烘干，測(cè)定干物質(zhì)(dry matter，DM)、總氮(total nitrogen，TN)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)，可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)、中性洗滌纖維(neutral detergent fibre，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fibre，ADF)。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定 pH值采用雷磁PHSJ-4F測(cè)定，氨態(tài)氮采用苯酚-次氯酸鈉比色法[2]，計(jì)算氨態(tài)氮/總氮(ammonia nitrogen/total nitrogen，AN/TN)，水溶性碳水化合物采用蒽酮-硫酸比色法[3]，采用SHIMADZE-10A型高效液相色譜儀測(cè)量乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。

1.3.3營(yíng)養(yǎng)成分及黃酮含量的測(cè)量 65℃ 烘箱中烘干 48 h，進(jìn)行干物質(zhì)含量測(cè)量，采用范氏方法(Van Soest)測(cè)定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量[4]，粗蛋白采用Tecator 1030型全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)量。按照薄亞光等[5]方法進(jìn)行，在分光光度計(jì)510 nm處測(cè)樣品的吸光度，計(jì)算黃酮總含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用T檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)兩個(gè)變量之間進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿青貯過(guò)程中pH值、干物質(zhì)和乳酸含量的變化

由表2可知，在青貯3 d到60 d，添加乳酸菌組干物質(zhì)含量高于對(duì)照組，但差異不顯著。兩組pH值變化較大，在青貯第3 d沒(méi)有明顯差異，第5 d到60 d乳酸菌組低于對(duì)照組且差異顯著(P<0.05)。乳酸含量隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，5 d到60 d乳酸菌組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 苜蓿青貯過(guò)程中pH值、干物質(zhì)和乳酸含量的變化Table 2 Changes of pH, dry matter and lactic acid contents of alfalfa silage during ensiling

2.2 苜蓿青貯過(guò)程中揮發(fā)性脂肪酸含量的變化

由表3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組乙酸含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，乳酸菌組乙酸含量低于對(duì)照組， 7 d到60 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。青貯過(guò)程中乳酸菌組丙酸含量除了在青貯15 d高于對(duì)照組外，其他時(shí)間均低于對(duì)照組，并在7 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。青貯3 d和30 d丁酸含量乳酸菌組均低于對(duì)照組。乳酸菌組乳酸/乙酸高于對(duì)照組，除3 d外，均差異顯著(P<0.05)。

表3 苜蓿青貯過(guò)程中揮發(fā)性脂肪酸含量的變化Table 3 Changes of volatile fatty acid contents of alfalfa silage during ensiling

2.3 苜蓿青貯過(guò)程中氨態(tài)氮/總氮及可溶性碳水化合物含量的變化

由表4可知，青貯過(guò)程中氨態(tài)氮/總氮隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并且乳酸菌組始終低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組可溶性碳水化合物在青貯過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，乳酸菌組呈先增高后降低變化趨勢(shì)，乳酸菌組高于對(duì)照組，但差異不顯著。

表4 苜蓿青貯過(guò)程中氨態(tài)氮/總氮及可溶性碳水化合物含量的變化Table 4 Changes of ammonia nitrogen/total nitrogen and water-soluble carbohydrate contents of alfalfa silages during ensiling

2.4 苜蓿青貯過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮含量的變化

由表5可知，青貯過(guò)程中乳酸菌組與對(duì)照組相比粗蛋白含量無(wú)明顯差異。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，并且乳酸菌組酸性洗滌纖維在7 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。青貯過(guò)程中乳酸菌組和對(duì)照組黃酮含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，30 d乳酸菌組黃酮含量高于對(duì)照組，并且差異顯著(P<0.05)。

表5 苜蓿青貯過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮含量的變化Table 5 Changes of nutrition and flavonoids contents of alfalfa silage during ensiling

2.5 黃酮與乳酸和pH值的回歸及相關(guān)分析

由表6可知，無(wú)論是乳酸菌組還是對(duì)照組，苜蓿青貯過(guò)程中pH值和乳酸含量對(duì)黃酮影響很大，兩組中黃酮和pH值呈明顯的負(fù)相關(guān)(P<0.05)，對(duì)照組中黃酮與乳酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表6 黃酮與乳酸和pH值的回歸分析和相關(guān)性分析Table 6 Regression and correlations analysis of flavonoids between lactic acid and pH

3 討論與結(jié)論

3.1 乳酸菌對(duì)苜蓿青貯過(guò)程中發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯發(fā)酵過(guò)程伴隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的改變，試驗(yàn)苜蓿青貯過(guò)程中干物質(zhì)含量均有下降，添加乳酸菌后干物質(zhì)含量高于對(duì)照組，添加乳酸菌5 d青貯飼料pH值4.77、第7 d為4.08，達(dá)到優(yōu)質(zhì)青貯飼料的要求。試驗(yàn)中對(duì)照組乙酸含量在后期顯著高于乳酸菌組，乳酸/乙酸含量低于乳酸菌組，表明添加乳酸菌后苜蓿青貯過(guò)程中以同型發(fā)酵為主時(shí)期延長(zhǎng)，減少了干物質(zhì)的損失。丁酸和氨態(tài)氮含量是衡量青貯飼料優(yōu)劣的重要指標(biāo)[6]。添加乳酸菌后從3 d開(kāi)始氨態(tài)氮/總氮含量顯著低于對(duì)照組，表明添加乳酸菌使苜蓿原料草附著的乳酸菌數(shù)量增加，形成酸性環(huán)境，減少早期植物蛋白酶對(duì)含氮化合物的降解作用，降低氨態(tài)氮/總氮含量，改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

3.2 乳酸菌對(duì)苜蓿青貯過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分和黃酮含量的影響

青貯過(guò)程中無(wú)論對(duì)照組還是添加乳酸菌，苜蓿青貯飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，乳酸菌組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維低于對(duì)照組，可能是由于添加乳酸菌改善了發(fā)酵條件，增加青貯中有效乳酸菌數(shù)量，大量乳酸菌發(fā)酵利用了部分纖維而導(dǎo)致青貯苜蓿中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量降低，試驗(yàn)中乳酸菌組對(duì)粗蛋白含量沒(méi)有明顯的影響，這與賴(lài)玉嬌研究結(jié)果相一致[7]。青貯發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分及物質(zhì)的變化是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，原料所含的各種成分都可能發(fā)生變化，黃酮是苜蓿重要的生物活性物質(zhì)之一，隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮含量呈現(xiàn)升高的變化趨勢(shì)，添加乳酸菌后苜蓿黃酮含量在整個(gè)青貯過(guò)程中均高于對(duì)照組，并在青貯30 d差異顯著，表明添加乳酸菌能夠提高苜蓿中黃酮的含量，原因可能是苜蓿中黃酮類(lèi)化合物大部分與細(xì)胞壁中的木質(zhì)素結(jié)合在一起，青貯過(guò)程中可以破壞植物細(xì)胞壁，使萃取時(shí)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)更多釋放出來(lái)。

綜上所述，添加乳酸菌改善了苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，迅速降低pH值，提高乳酸含量，降低酸性洗滌纖維，增加苜蓿黃酮含量，并且苜蓿青貯過(guò)程中黃酮含量與pH值和乳酸呈顯著相關(guān)性。