萎胃康對萎縮性胃炎大鼠TFF3和Bcl-2表達的影響

林海燕 于佳寧 翟佳麗 趙 巖

(濱州醫學院,山東 煙臺 264003)

萎胃康對萎縮性胃炎大鼠TFF3和Bcl-2表達的影響

林海燕 于佳寧1翟佳麗 趙 巖

(濱州醫學院,山東 煙臺 264003)

目的以腸三葉因子(TFF3)和B細胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)兩種蛋白為切入點，探討萎胃康治療慢性萎縮性胃炎(CAG)的可能機制。方法SD大鼠84只隨機分為造模組70只，正常對照組14只。采用復合造模法制備CAG大鼠模型，經6 w造模成功后，將造模組剩余的60只大鼠隨機分為模型對照組及萎胃康高、中、低劑量組和陽性藥物組(12只/組)。各組給予相應的藥物，每天灌胃1次，連續治療30 d后，分別用Real-time PCR法和Western印跡法檢測各組大鼠胃黏膜TFF3和Bcl-2兩種蛋白的表達。結果與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表達和Bcl-2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表達和Bcl-2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；其中以萎胃康高劑量組降低最明顯，較萎胃康中、低劑量組有顯著差異(P<0.05)。結論抑制胃黏膜TFF3和Bcl-2表達是萎胃康顆粒治療CAG的機制之一。

萎胃康；萎縮性胃炎

慢性萎縮性胃炎(CAG)為消化系統的一種難治疾病，若伴有腸上皮化生或不典型增生，被稱為癌前病變。萎胃康顆粒系本課題組經多年臨床觀察研制出的一種治療CAG的有效方劑。經臨床研究及前期動物實驗研究證實對CAG有確切療效。本文以B細胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)和腸三葉因子(TFF3)兩種蛋白為切入點，研究萎胃康對CAG大鼠治療的機制。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠(體重180～200 g，溫度25℃，濕度50%)。萎胃康顆粒，組方為西洋參、白術、白芍、三七粉、延胡索、熊膽、甘草，由濱州醫學院附屬醫院制劑室提供；使用當日，配制成300、150和75 mg生藥/ml 3種不同濃度的藥液。維霉素糖衣片(湖北綠金子藥業有限責任公司，批號：100903)使用當日去糖衣，放入研缽中研為細末，用蒸餾水制成30 mg/ml懸濁液。水楊酸鈉(上海國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20100125)配成濃度為2%的水楊酸鈉溶液。TRIzol試劑盒(TaKaRa)、反轉錄試劑盒(Gene Copoeia.inc)、RNA-free and DNA-free(Bioteke CorporationTaq)、熒光定量試劑盒(Gene Copoeia.inc)。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1造模與分組 從84只SD大鼠中隨機取出70只為造模組，參照文獻〔1〕采用復合造模法制作大鼠CAG模型，即2%水楊酸鈉溶液，1次/d，每次灌胃2 ml，連續灌胃6 w，且灌胃前、后1 h禁食、禁水；術前3 w自由進食、進水；術后3 w單日禁食、不禁水，雙日足量喂食，自由進水，且進食后立即于溫水中游泳1次，時間為10 min。剩下的14只為正常對照組，正常飼養。6 w后，從造模組隨機取出10只、正常對照組隨機取出2只做常規病理。經病理確認造模成功后，將造模組余下60只大鼠隨機分為模型對照組、萎胃康高、中、低劑量組和陽性藥物組。除正常對照組和模型對照組灌胃生理鹽水1 ml/100 g體重外，其余各治療組分別給予300、150、75 mg生藥/ml的萎胃康水溶液和30 mg/ml的維酶素混懸液，均按1 ml/100 g體重，1次/d。持續治療30 d。

1.2.2取材與標本制備 末次給藥24 h后，以2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射。麻醉后，剖腹，摘取全胃，沿胃大彎側剪開，冷生理鹽水漂洗內容物。取胃小彎側胃竇部黏膜裝入凍存管中，封口膜封口后，放入液氮中保存。

1.2.3Real-time PCR法檢測TTF3 mRNA表達量 提取胃總RNA，反轉錄后進行PCR擴增。反應條件：預變性94℃，5 min；變性，95℃，30 s；退火，58℃，30s；延伸，72℃，30 s；共進行40個循環的擴增，72℃后延伸5 min。實驗中同步進行內參基因β-actin的定量檢測，以目的基因與內參基因相對濃度比作為目的基因的相對表達量。擴增反應在熒光定量PCR 儀上進行，各樣品的熒光信號值由熒光定量PCR 儀的支持軟件ABI Prism7000SDS software 實時產生并自動計算定量數值。

1.2.4Western印跡法檢測Bcl-2蛋白表達量 從胃組織中提取蛋白，測定蛋白的濃度。取40 μg總蛋白與上樣液混合，上樣前煮沸5 min變性，將蛋白加入點樣孔，保證每孔蛋白量相同。電泳初始電壓80 V，溴酚藍染料的前緣進入分離膠上緣后電壓提至100 V。濕轉法，轉膜條件：300 mA 恒流，90 min。轉膜結束后，PVDF 膜取出并用marker筆標記膜的方向。將膜完全浸沒于甲醇2 min，蒸餾水5 min，轉膜緩沖液15 min。5%BSA-TBST 稀釋一抗，1∶1 000，4℃水平搖床孵育過夜。次日，TBST 洗3 次，每次10 min。5% BSATBST稀釋二抗，1∶500，室溫孵育45 min。TBST洗膜3 次，每次10 min。加入顯影液，暗室顯色，掃描膠片，用軟件分析目的條帶灰度，經內參β-actin 校正后進行統計學分析。

1.3統計學處理 使用SPSS19.0軟件計量數據組間差異采用One-Way ANOVA分析。

2 結 果

2.1各組大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表達量的比較 模型對照組TFF3 mRNA表達(1.211±0.037)較正常對照組(1.077±0.009)顯著升高(P<0.05)；藥物治療后，各治療組較模型對照組顯著降低，以萎胃康高劑量組(1.096±0.052)降低最明顯，萎胃康中、低劑量組(1.128±0.013,1.156±0.026)較萎胃康高劑量組有顯著差異(P<0.05)，陽性藥物組為1.117±0.023。

2.2各組大鼠胃黏膜Bcl-2蛋白表達量比較 模型對照組Bcl-2蛋白表達〔(101.02±4.61)×10-3〕最高，其次是萎胃康低劑量組〔(73.00±3.96)×10-3〕、萎胃康中劑量組〔(64.45±2.87)×10-3〕、陽性藥物組〔(56.67±4.08)×10-3〕、萎胃康高劑量組〔(52.15±2.09)×10-3〕(圖1)。正常對照組〔(54.50±4.60)×10-3〕、各治療組較模型對照組有顯著性差異(P<0.05)；與萎胃康高劑量組比較，萎胃康中、低劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。

1：正常對照組；2：模型對照組；3：萎胃康低劑量組；4：萎胃康中劑量組；5：萎胃康高劑量組；6：陽性藥物組圖1 各組大鼠胃黏膜Bcl-2蛋白表達量

3 討 論

CAG在中醫學中屬于“胃脘痛”、“嘈雜”、“胃痞”等范疇。大多由于飲食不節，戕傷中州；或外邪內侵，損及脾胃；或憂思郁怒，肝失疏泄，橫逆犯胃；或稟賦不足，脾胃虛弱等。病變初期以濕熱阻滯、氣郁不暢為主，久則脾胃氣陰受損，或脾氣虛弱或胃陰損傷，進一步發展可因氣不行血或陰不榮絡致胃絡血瘀。據此，筆者確立了補脾健胃、益氣養陰、理氣活血解毒之組方原則，創立了臨床經驗方萎胃康。方中西洋參為君藥，白術、白芍為臣藥，延胡索、三七、熊膽為佐藥，甘草為佐使藥。諸藥相合，具有陰陽平衡、寒熱互制、攻補兼施、升降協調的特點。

方中西洋參中多種組分均具有抗腫瘤活性，Murphy等〔2〕研究表明人參皂苷Rg3具有抗癌活性；白術具體胃黏膜保護和抗腫瘤作用，沈國慶等〔3〕將從白術揮發油中分離得到的3個化合物，按不同劑量進行抗腫瘤實驗，結果發現均有抑瘤作用；延胡索中的總生物堿是延胡索抗腫瘤的主要活性成分，它可在體外對腫瘤細胞的增殖產生較強的抑制作用，推測機制與誘導細胞凋亡、改變細胞周期時相分布、改變HepG2細胞mRNA表達譜有關〔4〕；以三七總甙為主的中藥提取物能使原癌基因C-myc的表達減弱，同時增強抑癌基因P16的表達，可能是三七總甙為主的中藥提取物治療胃癌前病變有效的機制之一〔5〕；熊膽能有效清除亞硝胺前體物——亞硝酸鈉，并阻斷二甲基亞硝胺在體外的合成，表明熊膽能預防某些癌癥。

TFF是一組具有特定三葉結構域的小分子多肽，在哺乳動物中包括3 個因子：乳腺癌相關肽TFF1、解痙多肽TFF2和腸三葉因子TFF3。其中，TFF3 參與受損胃黏膜修復，可保護胃腸黏膜，其表達與胃黏膜的損傷程度呈正相關〔6〕。一旦胃黏膜的修復得以完成，細胞停止移走。國外研究成果表明，在胃黏膜由腸化到不典型增生到胃癌的發展過程中，其表達不斷增強〔7〕。國內，黃亞平等〔8〕亦有同樣的報道。

根據TFF3 對胃黏膜的保護作用機制，推測中藥萎胃康在治療CAG 的過程中，TFF3 是過度表達的。隨著疾病好轉，TFF3 表達也隨之下降。TFF3在此過程中起到了參與損傷黏膜再生和修復的作用。

正常胃黏膜凋亡細胞較少，胃黏膜上皮組織依靠維持細胞凋亡和增殖的平衡來保持正常狀態。在胃黏膜的炎癥病理變化中凋亡細胞明顯增多，這種平衡被打破進而導致疾病的發生。1984 年，由Tsujimoro等最先分離出來Bcl-2，其過度表達會抑制細胞的凋亡，使細胞高速增殖，為向惡性細胞轉化提供條件。腫瘤的發生是細胞增殖和凋亡異常的疾病。因此，有學者推測Bcl-2過度表達是胃癌演化過程中的早期事件〔9〕。

根據Bcl-2抑制細胞凋亡的作用，推測胃康在治療CAG 的過程中，Bcl-2是過度表達的。隨著疾病好轉，Bcl-2表達也隨之下降，并具有預防萎縮性胃炎癌變的作用。綜上所述，抑制胃黏膜TFF3和Bcl-2的表達是萎胃康顆粒治療CAG的機制之一。

1張淑芹，趙林山，鄭繼奎.慢性萎縮性胃炎動物模型的復制〔J〕.哈爾濱師范大學自然科學學報，2001；17(6)：81-3.

2Murphy LL.American Ginseng in the prevention and treatment of human breast cancer〔J〕.ANSI Std，2001；39(18)：298-102.

3沈國慶，何法霖，李鳳新，等.白術揮發油化學成分及抗腫瘤實驗研究〔J〕.北京中醫藥大學學報，2009；32(6)：413-5.

4張國鐸.活性指導下中藥獨活與延胡索抗腫瘤有效成分的分離及其抑瘤作用研究〔D〕.南京：南京中醫藥大學，2009.

5李金霞.三七的藥效與作用機制〔J〕.中外健康文摘，2008；5(4)：167.

6Ogata H，Podolsky DK.Trefoil peptide expression and secretion is regulated by neuropeptides and acetylcholine〔J〕.Am J Physio，1997；273(2 Pt1)：348.

7Leung WK，Yu J，Chart FK，etal.Expression of trefoil peptides(TFF1，TFF2，and TFF3) in gastric carcinomas，intestinal metaplasia，and non-neoplastic gastric tissue〔J〕.J Pathol，2002；197(5)：582.

8黃亞平，雷 琳，朱慶茹.胃癌及癌前病變組織三葉因3表達的相關性研究〔J〕.內科，2009；4(6)：854.

9Lkeda M，Shomori K.Frequent occurrence of spoptosit in an early event in the oncogenesis of human gastric carcinoma〔J〕.Virchows Arch，1998；432(1)：43.

〔2016-12-10修回〕

(編輯 曲 莉)

EffectofWeiweikangonTTF3andBcl-2expressionsinchronicatrophicgastritisinrats

LINHai-Yan，YUJia-Ning，ZHAIJia-Li，etal.

BinzhouMedicalUniversity，Yantai264003，Shandong，China

ObjectiveTo observe the effect of Weiweikang on the expressions of intestinal trefoil factor (TTF3) and B cell lymphoma 2 (Bcl-2) in chronic atrophic gastritis (CAG) in rats.Methods84 SD rats were randomly divided into model (n=70) and blank groups(n=14). CAG models were induced by composite molding method. After model induction, 60 remaining rats in model group were equally and randomly divided into model, Weiweikang high, middle and low dose and positive drug groups. Rats of each group were given the corresponding drug once daily. After treatment for 30 days, the expression of TTF3 mRNA was detected by Real-time PCR and the expression of Bcl-2 was detected by Western blot.ResultsCompared with those of normal group, the expressions of TTF3 and Bcl-2 in model group were significantly increased(P<0.05). Compared with those of model group, the expressions of TTF3 and Bcl-2 in each treatment group were significantly reduced(P<0.05). The expressions of TTF3 and Bcl-2 in Weiweikang high dose group were reduced most obviously compared with those of Weiweikang middle and low dose groups(P<0.05).ConclusionsThe mechanism of Weiweikang treating CAG might be related to inhibiting the expressions of TTF3 and Bcl-2.

Weiweikang;Chronic atrophic gastritis

國家自然科學基金項目(81273724)；山東省自然科學基金項目(ZR2014HL094)；山東省中醫藥科技發展計劃項目(2013-249)

趙 巖(1964-)，女，教授，碩士，碩士生導師，主要從事中藥復方治療消化系統疑難雜癥的基礎研究。

林海燕(1978-)，女，副教授，博士，碩士生導師，主要從事中藥復方藥理研究。

R285

A

1005-9202(2017)17-4183-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.006

1 濱州醫學院煙臺附屬醫院