野生麻花秦艽中龍膽苦苷和黃酮對牧草的化感作用及抗氧化性研究

丁春發，魏小紅

（甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070）

麻花秦艽（G.stramineaMaxim.）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gen-tiana）秦艽組（Sect.CruciataGaudin）多年生草本植物，花中黃酮類物質含量較高，其根是我國重要的常用中藥材之一，已被列入國家三級保護藥材行列［1］，活性成分主要是龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷，其中龍膽苦苷具有多方面的藥理作用［1］。隨著中藥材市場需求的不斷擴大，藥用植物人工栽培種類和規模也在不斷增加。在栽培的藥用植物中，根類藥材占70%左右，生產中絕大多數根類藥材會產生連作障礙，連作障礙已成為制約我國中藥材可持續發展的重大問題；連作使得土壤細菌群落結構多樣性急劇下降，微生物種類減少，病原菌增多，嚴重影響到微生態環境的穩定性，造成土壤質量退化和土壤污染，這也是造成藥用植物栽培過程中質量和產量下降的一種重要因素［2］。

研究發現，藥用植物連作障礙與其產生的化感物質密切相關［3］，化感作用是植物爭奪土壤中的養分、空間及競爭生態位而形成的對外界環境的一種適應機制［4］。大多數藥用植物可以向環境中釋放次生代謝產物即化感物質對周圍植物起作用［5］，龍膽苦苷和黃酮不僅是主要的化感物質，而且是中草藥中主要的活性成分和抗氧化物［6-7］；豆科牧草輪作能使土壤微生物群落復雜程度顯著增加，大幅度改良土壤質量，且改良效果隨豆科植物品種不同、連作年限長短而存在差異［8-11］。對于秦艽的研究前人已在其藥用成分、藥理與栽培方面做了大量工作，但其主要的次生產物龍膽苦苷和黃酮的化感作用及其抗氧化性還鮮有報道。本文分別以麻花秦艽根、花為原料，利用超聲提取法對龍膽苦苷和黃酮進行提取，通過龍膽苦苷和黃酮對受體植物種子萌發及胚根生長的影響、活性氧和自由基清除能力的研究揭示其化感作用及其抗氧化性，建立麻花秦艽和豆科牧草之間的輪作、間作和套作體系，緩解或解除麻花秦艽栽培過程中的連作障礙，從而為麻花秦艽的人工栽培和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集地自然概況和受體植物

野生麻花秦艽采集于天祝藏族自治縣金強河封育多年的天然草地，其位于甘肅省中部，祁連山東端，地處青藏、黃土、內蒙古三大高原交匯過渡地段，海拔2500～3200m，該地區氣候濕潤，年平均氣溫-1℃～1.3℃，年降水量265～600mm，全年日照時數2500～2700h，氣候屬典型的大陸性高原季風氣候，植被生長季90～145d。

麻花秦艽屬于多年生的藥用植物，秋季時節其花和葉成熟，2015年9月采集生長期達3年以上且根、葉、花完整的植株，洗凈，將其根、花分離后自然風干，粉碎機粉碎過0.45mm篩后貯藏備用。

受體植物：紫花苜蓿（‘阿爾岡金’）和紅三葉（‘Marathon’）都屬于優良豆科牧草，二者在甘肅境內多有分布，其種子購于甘肅省農科院。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生麻花秦艽龍膽苦苷提取液和黃酮提取液的制備 參照康輝等［12］的方法：稱取干燥的野生麻花秦艽根粉末5g，按照料液比1∶30的比例加入150mL蒸餾水，利用超聲提取法，在40℃下提取40 min，然后用離心機在3500r·min-1離心5min，合并上清液并用蒸餾水定容至150mL，吸取少量在273nm處測定其吸光值，代入標準曲線方程，求得龍膽苦苷提取液的濃度為12.60mg·mL-1，按不同倍數稀釋得到6.30，2.52，1.26，0.63mg·mL-1的龍膽苦苷稀釋液，備用。

參照康輝和杜芳艷等［12-13］的方法：稱取干燥的野生麻花秦艽花粉末5g，按照料液比1∶40的比例加入200mL 60%乙醇，在最大超聲頻率下，于65℃超聲處理20min后，冷卻過濾，濾渣重復提取兩次，合并濾液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至50mL，按1∶1比例加入石油醚除去脂溶性物質和葉綠素等，回收石油醚，下層粗提液轉入150mL三角瓶中，用蒸餾水定容至刻度，吸取少量在510nm處測定其吸光值，代入標準曲線方程，求得黃酮提取液的濃度為3.90mg·mL-1，按不同倍數稀釋得到1.95，0.78，0.39，0.195mg·mL-1的黃酮稀釋液，備用。

1.2.2 種子發芽及胚根生長試驗 采用培養皿濾紙法［14］：試驗于2015年12月在甘肅農業大學生命科學技術學院植物生理實驗室進行，挑選飽滿、均勻、大小一致的紅三葉和紫花苜蓿種子，用0.1%HgCl2溶液消毒3～5min，無菌蒸餾水對消毒后的種子反復多次沖洗后均勻置于預先處理過的培養皿中，每皿50粒，每個培養皿分別加入不同濃度麻花秦艽龍膽苦苷或者黃酮提取液5mL，對照加入5 mL無菌蒸餾水，每個處理組3次重復。然后分別置于（21±2）℃、（28±2）℃恒溫光照培養箱內，在12h光照/12h黑暗的條件下進行培養，整個培養過程中確保加濕器正常工作。于每天早上8：00統計種子發芽數，統計試驗結束的標記是以連續3d不再有受體植物種子發芽，計算種子最終發芽率、發芽勢（4d）和發芽指數［15］，7d時測定發芽種子的胚根長度。

發芽率（GP）=7d發芽種子數/測試種子總數×100%［16］

發芽勢（GE）=前3d發芽種子數/種子總數×100%［16-17］

發芽指數（GI）=∑（Gt/Dt）［18］（式中，Dt為日發芽種子數，Gt為與Dt相應的每天的發芽種子數。）

化感效應指數RI=1-C/T（T≥C），或者RI=C/T-1（T＜C）（式中，C為對照發芽率，T為處理發芽率。RI表示化感作用強度大小，正值表示促進，負值表示抑制，絕對值大小反映化感作用的強弱［19］。）

1.2.3 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對羥自由基（.OH）清除能力測定 Fenton反應體系的建立［20］：取若干個具塞試管，依次加入0.006mmol·mL-1的FeSO4溶液2mL，然后于不同試管中依次加入12.60，6.30，2.52，1.26，0.63mol·mL-1龍膽苦苷提取液2mL，再依次加入0.006mmol·mL-1的H2O2溶液2mL，搖勻靜置10min，最后加入0.006mmol·mL-1的水楊酸-乙醇溶液2mL，搖勻，37℃恒溫水浴15min，在536nm處測定吸光值Ai；用蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液，其他同上，在536nm處測定吸光值Aj，用以排除樣品本身的顏色干擾；用蒸餾水代替龍膽苦苷提取液，其他同上，測定其吸光值A0。

用3.90，1.95，0.78，0.39，0.195mg·mL-1的黃酮提取液替換龍膽苦苷提取液，測量黃酮提取液對羥自由基（OH.）清除率。

清除率/%=［1-（Ai-Aj）/A0］＊100

1.2.4 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對超氧陰離子（O-.2）清除能力測定 鄰苯三酚反應體系的建立［21］：取若干個具塞試管，依次加入0.05 mmol·mL-1Tris-HCl（pH=8.20）緩沖液5mL，與不同試管中依次加入不同濃度龍膽苦苷提取液0.2mL，25℃恒溫水浴10min，再依次加入0.1mL經25℃預熱過的0.006mmol·mL-1鄰苯三酚溶液，快速搖勻于25℃恒溫水浴5min，最后加入1 mL 0.01mmol·mL-1HCl終止反應，在510nm處測定吸光值Ai；用0.01mmol·mL-1HCl代替鄰苯三酚溶液，其他同上，在510nm處測定吸光值Aj，用以排除樣品本身的顏色干擾；用蒸餾水代替龍膽苦苷提取液，其他同上，測定其吸光值A0。

用不同濃度的黃酮提取液替換龍膽苦苷提取液，測量黃酮提取液對超氧陰離子（O-.2）的清除率。

清除率/%=［1-（Ai-Aj）/A0］＊100

1.2.5 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對二苯苦味酰肼自由基（DPPH.）清除能力測定 參照張志國［22］等的方法：取若干個具塞試管，依次加入0.0002mmol·mL-1DPPH-乙醇溶液2mL，再分別加入不同濃度的龍膽苦苷提取液2mL，震蕩搖勻靜置30min后，在517nm處測定吸光值Ai；取若干個具塞試管，在不同試管中先分別加入不同濃度的龍膽苦苷提取液2mL，再依次加入95%乙醇溶液2mL，震蕩搖勻靜置30min后，在517nm處測定吸光值Aj；于具塞試管依次加入2mL 0.0002 mmol·mL-1DPPH-乙醇溶液，2mL 95%乙醇溶液，震蕩搖勻靜置30min后，在517nm處測定吸光值AC。

用不同濃度的黃酮提取液替換龍膽苦苷提取液，測量黃酮提取液對DPPH.的清除率。

清除率/%=［1-（Ai-Aj）/AC］＊100

1.2.6 數據分析 各項試驗均重復3次，所得數據用Excel 2010軟件求得平均值和標準誤，采用SPSS軟件對不同處理進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對紅三葉和紫花苜蓿種子發芽的影響

由表1、表2可知，不同濃度的龍膽苦苷提取液對紅三葉和紫花苜蓿種子的萌發都有不同程度的抑制作用，抑制作用強弱與濃度大小呈正相關，與對照差異顯著（P＜0.05）。從總體上看，同濃度下龍膽苦苷提取液對紅三葉發芽率（G）、發芽勢（GE）和發芽指數（GI）的化感效應小于紫花苜蓿。同樣，不同濃度的黃酮提取液對紅三葉和紫花苜蓿種子的萌發也有不同程度的抑制作用，相比較而言，黃酮提取液濃度為0.78mg·mL-1時對紅三葉發芽率、發芽勢和發芽指數的化感指數大于紫花苜蓿，而濃度為1.95和3.90mg·mL-1時，對紫花苜蓿發芽率、發芽勢和發芽指數的化感指數大于紅三葉。

表1 野生麻花秦艽龍膽苦苷提取液對紅三葉和紫花苜蓿種子發芽的影響Table 1 Effects of aqueous extracts of gentiopicroside from Feral G.straminea Maxim.on seed germination of Trifolium pratense and Medicago sativa

表2 野生麻花秦艽黃酮提取液對紅三葉和紫花苜蓿種子發芽的影響Table 2 Effects of aqueous extracts of flavones from Feral G.straminea Maxim.on seed germination of Trifolium pratense and Medicago sativa

2.2 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對紅三葉和紫花苜蓿胚根生長的影響

由圖1、圖2可知：不同濃度的龍膽苦苷提取液對紅三葉和紫花苜蓿的胚根都表現出抑制作用且與對照差異顯著（P＜0.05）。濃度越大，抑制作用越明顯，總體呈正比關系，但濃度從2.52mg·mL-1增大到6.30mg·mL-1時，其抑制作用增強更明顯。由于不同植物胚根生長發育的內部條件不同，因此不能說明龍膽苦苷提取液對哪種植物胚根的生長抑制作用更明顯。同樣，不同濃度的黃銅提取液對紅三葉和紫花苜蓿的胚根也表現出不同程度的抑制作用且與對照差異顯著（P＜0.05）。濃度越大，抑制作用越明顯，濃度為3.90和1.95mg·mL-1時，對紅三葉胚根的抑制作用不顯著。

2.3 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮對羥自由基（.OH）清除能力

不同濃度的龍膽苦苷提取液對羥自由基都有一定的清除能力，濃度較低時，隨濃度增大，清除率逐漸增大，當濃度為2.52mg·mL-1時，對.OH的清除率最大，達到83.06%，隨濃度繼續增大，清除率逐漸降低且濃度為1.26和0.63mg·mL-1時差異不顯著（圖3）。而黃酮提取液對·OH的清除率與龍膽苦苷提取液不同，濃度偏低時，隨濃度增加，清除率逐漸增大，濃度為1.95mg·mL-1時，清除率達最大值98.55%，隨濃度繼續增加，清除率降低，濃度為0.39mg·mL-1時與3.90，0.78及0.195 mg·mL-1之間差異都不顯著（圖4）。

圖1 不同濃度野生麻花秦艽龍膽苦苷提取液對紅三葉和紫花苜蓿胚根長的影響Fig.1Radicle length of Trifolium pratense and Medicago sativa treated with different concentration of gentiopicroside extracts from Feral G.straminea Maxim.

圖2 不同濃度野生麻花秦艽黃酮提取液對紅三葉和紫花苜蓿胚根長的影響Fig.2 Radical length of Trifolium pratense and Medicago sativa treated with different concentration of flavones extracts from Feral G.straminea Maxim.

2.4 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮對超氧陰離子（O-.2 ）清除能力

不同龍膽苦苷濃度對O-.2的清除率不同，濃度為1.26mg.mL-1時，清除率最大，達到55.32%，隨龍膽苦苷濃度持續增加，清除率下降，并且波動范圍很小且與其他濃度之間差異顯著（P＜0.05）（圖3）。黃酮提取液對O-.2的清除率表現為濃度低時，清除率較高，當濃度大于0.39mg·mL-1時，隨濃度增大，清除率逐漸減小，3.90和1.95及0.39和0.195 mg·mL-1間差異都不顯著（圖4）。

2.5 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮對二苯苦味酰肼自由基（DPPH.）清除能力

不同濃度的龍膽苦苷提取液對DPPH.的清除能力不同，濃度為0.63mg·mL-1時，清除率最小，僅為54.25%，濃度為2.52mg·mL-1時，清除率達到最大值88.30%，之后隨濃度增加清除率下降且達到穩定，12.60與6.30mg·mL-1間差異不顯著，與其他濃度間差異顯著（P＜0.05）（圖3）。黃酮對DPPH.的清除率表現出濃度較低時，隨濃度增加清除率逐漸增大，濃度為1.95mg·mL-1時清除率達最大值95.59%，隨后清除率隨濃度增加而下降，濃度為3.90mg·mL-1時清除率僅為76.47%，濃度為0.39mg·mL-1時，與3.90和0.78及0.195mg·mL-1之間差異都不顯著（圖4）。

圖3 不同濃度野生麻花秦艽龍膽苦苷提取液的清除率Fig.3 Clearance rate of different concentration of gentiopicroside extracts from Feral G.straminea Maxim.

圖4 不同濃度野生麻花秦艽黃酮提取液的清除率Fig.4 Clearance rate of different concentration of flavones extracts from Feral G.straminea Maxim.

3 討論

種子萌發對物種更新至關重要，種子的成功發芽決定著植物種群的生存和繁衍［23］，而種子發芽容易受環境脅迫的影響，被認為是植物生活周期中最重要和最脆弱的階段［23］。種子發芽率、發芽勢和發芽指數均可反映種子發芽能力，發芽率與種子生活力是一致的，發芽指數反映了種子發芽的速率和整齊程度［24］。一般而言，環境脅迫作用越強，對種子發芽過程中產生的抑制作用也越強，但同一種脅迫作用對不同植物種子發芽產生的抑制作用表現出差異性［25-26］。種子的發芽受內源抑制物［27］和化感物質的影響，化感物質可以降低種子發芽率并延緩種子發芽時間［28］。本研究中，兩種受體植物紫花苜蓿和紅三葉種子經龍膽苦苷和黃酮提取液處理后，其發芽率顯著降低，且隨濃度增加，抑制作用逐漸增強；同時，隨提取液濃度增大，受體植物種子發芽指數下降，發芽時間延長。化感活性物質能夠影響種子內部物質代謝及各種代謝關鍵酶的活性，引起種子劣變，使種子活力降低，進而使得發芽率降低，延遲發芽時間［28-29］；兩種受體植物對同一濃度的龍膽苦苷或黃酮提取液的脅迫效應表現出明顯的不一致性，且在低濃度條件下，這種差異性更為明顯：同濃度下龍膽苦苷提取液對紅三葉發芽率、發芽勢和發芽指數的化感效應小于紫花苜蓿，說明龍膽苦苷對紫花苜蓿的化感抑制作用要強于紅三葉。相比較而言，黃酮提取液濃度為0.78mg·mL-1時對紅三葉發芽率、發芽勢和發芽指數的化感指數大于紫花苜蓿，而濃度為1.95和3.90mg·mL-1時，對紫花苜蓿發芽率、發芽勢和發芽指數的化感指數大于紅三葉，可能是由于二者種子的物質組成和結構不同，在萌發過程中，化感物質對其基本代謝過程和生長調節系統的脅迫影響也不同，說明化感作用不僅與受體植物種類有關，與供體植物本身也有關聯［30］。由于龍膽苦苷和黃酮提取液對紅三葉的抑制作用相對較弱，在秦艽的栽培過程中可以作為輪作、間作或套作植物進行倒茬，緩解其連作障礙。

近年來，國內外越來越多的學者對藥用植物的自毒作用及化感作用進行了研究［13，31-39］。在自然生態系統中，當化感物質在土壤中積累到一定量后，就會延緩植物的發芽時間、降低植物的發芽率，進而影響植物的生長發育［39］，但是，化感物質起作用需要達到一定的濃度，在自然條件下，外來植物向土壤中釋放的化感物質濃度只有達到了某一有效作用閾值，才會對周圍的伴生植物產生抑制效果［40］。化感物質能影響細胞分裂，細胞伸長和根尖的細微結構，對植物的幼根有促進或者抑制作用［41-42］。本研究證明，秦艽中龍膽苦苷和黃酮提取液對受體植物紫花苜蓿和紅三葉的種子萌發和胚根的生長都有不同程度的影響且都表現出抑制作用，隨著濃度增大抑制作用逐漸增強；相同濃度的龍膽苦苷和黃銅提取液對紫花苜蓿和紅三葉的發芽抑制和胚根生長的抑制作用不同，說明不同植物對化感脅迫的敏感性表現出差異性。化感物質可以通過莖葉揮發、根系分泌、雨露淋洗和植物殘體腐解等方式釋放到外界環境中［43-45］，化感物質進入土壤后，在到達目標植物之前，要經過土壤顆粒和土壤微生物的吸附、運輸、轉化甚至降解，其結構、有效性和活性均會發生復雜的變化，導致對受試植物的化感效應出現相應變化［46］。藥用植物根系分泌物的化感自毒作用［46］、根系分泌物對生態效應的間接作用及土壤微生物區系紊亂是導致植物連作障礙的主要因素［47-48］。龍膽苦苷和黃酮作為藥用植物麻花秦艽的活性成分，其可能通過特定方式釋放到自然生態系統中，對自身的連作產生不良效應、對伴生植物及輪作作物的發芽和生長產生抑制和毒害。

自由基是機體代謝過程中產生的中間產物，其參與的很多反應對機體是有益的，但是，在某些病理狀態下，機體可能產生大量高反應活性的氧自由基［49］。自由基及其誘導的氧化反應是導致生物衰老和某些疾病如癌癥、糖尿病、心血管疾病等的重要因素［50-52］。超氧陰離子可以反應生成其他的氧自由基［53］；羥基自由基可以破壞蛋白質、膜脂、糖類、核酸等生物大分子的空間結構，使其喪失生物學功能［54］。但生物體內存在抗氧化酶和抗氧化劑如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（POD）等自由基清除體系［51］，另外黃酮、多酚、多糖類、環烯醚萜苷等化合物能調節和提高體內抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px等）的活性［55］，使得機體內氧自由基的產生和清除處于一種動態平衡；抗氧化劑或抗氧化酶單獨作用時，對自由基的清除能力要弱于共同作用時的清除能力，可能是二者的協同作用，提高了抗氧化酶的活性，增強了對自由基的清除能力［56］，因此，生物體內自由基的清除是多種因素共同作用的結果；DPPH·是以DPPH·自由基和DPPH·+兩種平衡態存在，抗氧化劑通過遞電子、遞質子清除DPPH·自由基或者使DPPH·自由基生成DPPH2最終分解成三硝基苯胺使其清除［57］。本研究表明，秦艽中不同濃度的龍膽苦苷和黃酮提取液對羥自由基（·OH）、超氧陰離子（O-2·）、二苯苦味酰肼自由基（DPPH·）均有較強的清除能力，且不同濃度的龍膽苦苷和黃銅提取液對三種自由基的清除能力有較大差異。已有研究證明，動物體內黃酮類物質可以直接捕捉和清除自由基，也能調節和提高抗氧化酶活性［58］，植物體內的黃酮類物質是不是通過這種途徑達到清除自由基的作用、麻花秦艽中的龍膽苦苷對自由基清除作用的機理是否也和黃酮一樣通過捕捉活潑的自由基或者通過抑制自由基引發劑達到抗氧化的目的，需進一步研究證實。

本試驗研究了中草藥麻花秦艽中龍膽苦苷和黃酮提取液的化感作用，結果表明二者對受體植物紫花苜蓿和紅三葉的種子萌發和胚根生長均表現出不同程度的抑制作用，且抑制作用與提取液濃度大小呈正比關系，已有研究證明黃酮能夠調節和激活抗氧化酶的活性，這可能是其對受體植物表現出化感作用的調節機制，龍膽苦苷與黃酮是否有相同的作用機制還需進一步研究。此研究為建立麻花秦艽與作物之間的輪作、間作及套作體系進而緩解并解除麻花秦艽栽培過程中的連作障礙，為藥用植物麻花秦艽的合理栽培提供一定的理論依據，為充分利用這一藥用植物資源奠定基礎。

4 結論

不同植物對化感脅迫的耐受能力不同，紫花苜蓿對化感脅迫的耐受能力弱于紅三葉；不同濃度的龍膽苦苷和黃銅提取液對自由基的清除能力表現出差異性且對自由基清除率達最大值時的最適濃度不同。