白三葉化感作用相關基因CHS的克隆及生物信息學分析

吳 榕，鄭國華，郝玉蘭

（1.內蒙古師范大學生命科學與技術學院，內蒙古 呼和浩特010022；2.呼和浩特市蔬菜技術推廣站，內蒙古 呼和浩特010070）

1984年，Rice提出“化感作用（allelopathy）是植物或微生物的化學分泌物對環境中其他植物或微生物的有利或不利的效應，即生化互作”。他涵蓋了植物之間、微生物之間以及植物和微生物之間的相互作用，而且主要物質是植物或微生物的次生代謝產物，即化感物質［1］。白三葉草是世界上分布較廣的一類草坪草，既可以綠化環境，也可以用于飼料。白三葉草坪中?；焐泻芏喾N雜草，如稗草（Echinochloacrus-galli（L.）Beauv）、苘麻（AbutilontheophrastiMedic.）、蓼（Polygonum）、反枝莧（Amaranthusretroflexus.L.）、野燕麥（AvenafatuaL.）、 蒲 公 英（Taraxacum mongolicumHand.）等20多種雜草，這些雜草對于白三葉的生長產生抑制作用，既影響美觀，同時還造成牲畜中毒，經研究證明，白三葉具有化感作用，充分利用其化感作用可以減少雜草對白三葉的侵害［2-5］。

研究表明，白三葉中的化感物質有很多種，已報道的研究結果發現，黃花草木樨（MelilotusofficinalisDesr.）、白三葉（TrifoliumrepensL.）、紅三葉（TrifoliumpretenseL.）、雜 三 葉（Trifolium hybridumL.）等豆科植物普遍含有丁香酸、香草酸、原兒茶酸、香豆酸、乙酸異戊酯、二氫香豆酮以及肉桂酸等多種酚酸類和類黃酮化感物質［6］。其中類黃酮類是一大類重要的次生代謝產物，在生物化感作用中有十分重要的作用。在植物體內類黃酮的生物合成途徑普遍存在，并產生豐富的次生代謝產物，統稱為類黃酮化合物，查爾酮合成異構酶是類黃酮化合物代謝中的關鍵酶類，直接影響到類黃酮的代謝過程［7-9］?？寺〔闋柾铣僧悩嬅富颍–HS）對于白三葉化感物質中類黃酮的產生和提純具有應用價值，所克隆的基因是控制白三葉化感物質的關鍵基因，如將克隆到的CHS基因構建植物表達載體，在白三葉或模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）、煙草（Nicotianatabacum）中表達，對基因的功能進行分析，同時利用轉基因植物對白三葉CHS基因對黃酮類代謝物質的含量、組成加以影響，進一步分析黃酮類代謝物質的變化，闡述黃酮類物質和植物化感作用之間的關系等，對于白三葉化感物質的進一步應用有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與菌種 植物材料白三葉‘龍坪1號’（Trifoliumrepens‘Longping No1’），大腸桿菌DH5α感受態購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 本研究用到的主要試劑如表1所示：

1.2 方法

1.2.1 引物的合成及測序

1.2.1.1 白三葉CHS基因中間片段的簡并引物的設計［10］

在GenBank數據庫中檢索不同植物查爾酮合成酶（CHS）基因的氨基酸和核苷酸序列，利用生物學軟件進行比對分析，尋找基因序列的保守區域；使用Primer Premier 5.0根據氨基酸序列的保守區域設計簡并引物。引物序列如下：

利用TRIzol試劑提取白三葉RNA，去DNA，反轉錄成cDNA，按照Clontech公司RACE試劑盒說明書進行RACE試驗獲得cDNA全長。

1.2.1.2 RACE引物的設計

根據白三葉CHS基因中間片段的測序結果，按照Clontech公司RACE試劑盒說明書要求，使用Primer Premier 5.0分別設計5′RACE反應所需目的基因的下游特異性引物和3′RACE反應所需目的基因的上游特異性引物。引物序列如下：

本研究的引物合成和測序由上海生物工程技術服務有限公司完成。

1.2.2 序列分析 利用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）的Blast程序進行序列比對，CDD程序分析蛋白保守區域，用ORF finder工具（http：//wncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.ht ww.ml）分析開放閱讀框。利用 ExPASy（http：//www.expasy.org/proteomics）數據庫中的ProtParam軟件對推導氨基酸序列的分子質量、理論等電點、蛋白穩定性、總親水性等理化性質進行分析。GOR4進行二級結構預測。通過Expasy數據中的SWISS-MODEL工具（http：//swissmodel.expasy.org/）進行同源比對其三級結構預測。蛋白質家族 Pfam 數據庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/）進行蛋白保守區域分析。Clustx進行多重序列比對，并利用Mega5進行系統進化分析，算法采用鄰接法，bootstrap值設置為1000。

大豆、苜蓿基因序列從植物基因組數據庫（http：//www.phytozome.com/）獲得；擬南芥基因從擬南芥基 因組 數 據 庫 TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）中獲得；其他植物基因從GeneBank數據庫中獲得。

2 結果與分析

2.1 白三葉總RNA的提取

白三葉總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，電泳結果顯示：28SrRNA，18SrRNA，5SrRNA的條帶清晰，無拖帶現象；紫外分光光度計檢測OD260/OD280的值均＞2.0，OD260/OD230＞1.8，說明所提取的RNA純度較高，可用于后續試驗。

圖1 白三葉總RNA電泳結果Fig.1 Electrophoresis examination of total RNA of Trifolium repens

2.2 白三葉CHS基因中間片段的克隆與測序結果分析

利用PCR技術擴增得到了的條帶位于750bp和1000bp之間，與預期大小一致，結果如圖2所示。將該片段切膠回收后連入pEASY-T1Simple載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂于LB平板培養。藍白斑和菌落PCR挑選重組子后搖菌，菌液送上海生工測序，得到916bp的序列。

圖2 白三葉CHS基因中間片段PCR電泳圖Fig.2 Amplification of the CHSgene fragments by PCR fromTrifolium repens

利用Vector NTI Advance 10.3將白三葉CHS基因cDNA中間片段核苷酸序列推導出相應的氨基酸序列。經過NCBI數據庫的BLASTP工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析后發現，白三葉CHS中間片段編碼的氨基酸序列與苜蓿（Medicagosativa）、豌豆（Pisumsativum）、大豆（Glycinemax（L.）Merr）等其他豆科植物CHS蛋白氨基酸序列的相似度高達95%以上，因此推斷克隆到的是白三葉CHS基因中間片段。可以利用該中間片段的已知序列設計RACE引物，克隆基因cDNA全長。

2.3 白三葉CHS基因cDNA全長克隆

利用已測序中間片段序列設計的RACE引物，通過RACE技術擴增得到的白三葉CHS基因cDNA 3′末端序列和5′末端序列。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物如圖3所示。

其中1，2泳道為5′RACE結果，大小約750 bp，3，4泳道為3′RACE結果，大小約500bp。兩條電泳條帶大小都與預期相似。

圖3 白三葉CHS基因RACE電泳結果Fig.3 RACE PCR products of the CHSgene fragments by PCR of Trifolium repens

將電泳條帶切膠回收，回收到的目的條帶與pEASY-T1Simple載體相連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，通過菌落PCR和酶切鑒定出陽性克隆后，送上海生工生物工程有限公司測序。

測序后得到477bp的3′末端序列和724bp的5′末端序列，將克隆得到的5′RACE序列、3′RACE序列和中間片段的測序結果用Vector NTI Advance 10.3拼接得到白三葉CHS基因1473bp長的cDNA序列，利用NCBI的BLAST工具進行比對分析，結果顯示該基因與同屬豆科的大豆、紫花苜蓿（Medicagosativa）和銀合歡（Leucaenaglauca（L.）Benth.）的CHS高度同源，說明克隆到的確實是白三葉CHS基因，該基因具有調控白三葉類黃酮化感物質前體查爾酮的功能。

在GeneBank中Blast的結果中未發現有三葉草CHS基因的報道，說明首次從白三葉中克隆得到了CHS基因。

2.4 白三葉CHS基因生物信息學分析

2.4.1 核苷酸分析 對克隆得到的CHS基因進行序列分析，利用NCBI中的ORF finder工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析預測CHS基因cDNA序列的開放閱讀框。結果表明克隆到的CHS基因cDNA全長序列1473 bp，其中包含了1170bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，103bp的5′UTR和200bp3′UTR，編碼389氨基酸。該基因的cDNA序列及所編碼的氨基酸序列如圖4所示。

圖4 白三葉CHS基因的cDNA全長及編碼的氨基酸序列Fig.4 Full-length of cDNA and amino acid sequences of CHS

2.4.2 蛋白質理化性質和氨基酸組成 用Ex-PASy的ProtParam進行預測表明：白三葉CHS基因編碼的蛋白分子量為42.803kDa，等電點5.75；不穩定系數-1.69。

白三葉CHS基因編碼氨基酸殘基組成情況如表2所示。

2.4.3 白三葉CHS基因編碼蛋白二級結構預測 用 HNN（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa＿automat.pl？page=/NPSA/npsa＿hnn.html）在線分析軟件分析預測本蛋白的二級結構，結果如圖5所示。從分析結果看，該蛋白的二級結構主要有無規則卷曲、α螺旋和β折疊，其中組成無規則卷曲的氨基酸有160個，占41.13%；組成α螺旋的氨基酸殘基有156個，占40.10%；組成β折疊的氨基酸殘基有73個，占總數的18.77%。這3種結構較為均勻的分布在整個蛋白序列中。

2.4.4 白三葉CHS基因編碼蛋白三級結構預測 利用Expasy數據庫中的SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）同源建模工具中的Automatic Mode算法進行三級結構的預測。將白三葉CHS氨基酸序列提交到數據庫后，檢索獲得一個同源性較高的蛋白質結構數據1suiC，以該蛋白序列的結構信息為原子模型數據庫自動進行同源建模，結果如圖6所示。該蛋白總體呈球形，β折疊主要埋藏于蛋白內部，α螺旋主要分布在蛋白外部。

表2 白三葉CHS基因編碼蛋白氨基酸殘基組成情況Table 2 Amino acid compositions of protein coded by CHSgene of Trifolium repeus

圖5 白三葉蛋白二級結構預測圖Fig.5 The secondary structure prediction of the CHSby HNN

圖6 同源建模得出的白三葉CHS蛋白三級結構Fig.6 Tertiary structure prediction of the CHSby SWISS-MODE

2.4.5 白三葉CHS基因編碼蛋白親水性分析應用ExPAS數據庫中的ProtScale工具（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.Pl）對白三葉CHS基因編碼蛋白進行了親水性分析。正值越大表示該區域越疏水，負值越大表示該區域越親水，介于+0.5到-0.5之間的主要為兩性氨基酸。由圖7可知，該蛋白中疏水性氨基酸較多，總體呈疏水性質。其中最大疏水性的氨基酸出現在351和352位，達到-2.911，而最大親水性出現在342位，達到2.422。而由ExPASy的ProtParam預測的親水性是-0.125，同樣屬于疏水蛋白，二者結果一致。

圖7 白三葉CHS氨基酸序列親/疏水性分析Fig.7 Predicted hydropathy plot of the deduced amino acid sequence of the CHS

2.4.6 白三葉CHS基因進化分析 在GeneBank數據庫中找到其他植物中的CHS基因，包括豌豆（Pisumsativum，P51081.1），苜蓿（Medicagotruncatula，XP＿003601648.1），鷹嘴豆（Cicerarietinum，XP＿004502226.1），陸地棉（Gossypiumhirsutum，ACH56521.1），水 稻（Oryzasativa，BAB39764.1）， 銀 白 楊（Populusalba，ABD24222.1），歐洲榛（Abiesalba，ABD38593.1），馬鈴薯（Solanumtuberosum，AGU70032.1），玉米（Zeamays，NP＿001149508.1），北美白松（Pinus strobus，CAA06077.1），矮牽牛（Petunia xhybrida，AF233638＿1），大豆（Glycinemax，AAB01004.1），虎杖（Polygonumcuspidatum，ABK92282.2），葡萄（Vitisvinifera，NP＿001267879.1），擬南芥（Arabidopsisthaliana，NP＿196897.1）

圖8 白三葉CHS基因進化分析Fig.8 Evolution analysis of CHSgene of Trifolium repeus

用這些基因的氨基酸序列進行系統進化分析，結果如圖8所示。圖中可以看出，白三葉CHS與同屬于豆科的苜蓿CHS、大豆CHS、鷹嘴豆CHS和豌豆CHS親緣關系最近，處于同一分支，而其不同科植物處于其他分支上，這與植物的分類關系是一致的。而單子葉植物水稻、玉米的CHS與白三葉CHS關系較遠。

3 討論與結論

類黃酮是一大類重要的次生代謝產物，類黃酮的合成途徑是目前研究較為清晰的次生代謝途徑［11］，植物類黃酮合成的前期途徑都是以香豆酰CoA和丙二酰CoA為前體，香豆酰CoA來自苯丙烷合成途徑（Phenylpropanoid pathway），丙二酰CoA來自乙酰CoA，二者在查爾酮合成酶（CHS）作用下形成查爾酮，這一步是類黃酮途徑的第一個限速步驟［12］。本研究首次從白三葉中克隆得到了調控類黃酮代謝的CHS基因，而這一基因在GeneB-nak中Blast的結果中未發現相關的報道，并對白三葉CHS基因進行了生物信息學分析，對克隆得到的CHS基因，利用NCBI中的ORF finder工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析預測CHS基因cDNA序列的開放閱讀框。結果表明克隆到的CHS基因全長cDNA序列1473 bp，其中包含了1170bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，103bp的5′UTR和200bp3′UTR，編碼389個氨基酸。同時預測到白三葉CHS基因編碼的蛋白分子量為42.803kDa，等電點5.75；不穩定系數 -1.69。CHS基因所編碼的蛋白質三級結構中β折疊主要埋藏于蛋白內部，而α螺旋主要分布于蛋白外部，該蛋白主要呈球形。從CHS基因編碼的蛋白質的親水性分析，該蛋白中疏水性氨基酸較多，總體呈疏水性質。在CHS基因進化分析中，從GeneBank數據庫中找到其他植物中的CHS基因，有這些基因的氨基酸進行系統進化分析，白三葉CHS與同屬于豆科的苜蓿CHS、大豆CHS、鷹嘴豆CHS和豌豆CHS親緣最近，而單子葉植物水稻、玉米的CHS與白三葉CHS關系較遠。

據以上基因信息推測，所克隆的基因是控制白三葉化感物質的關鍵基因，下一步計劃將克隆到的CHS基因構建植物表達載體，在白三葉或模式植物擬南芥（煙草）中表達，對基因的功能進行分析。利用轉基因植物對白三葉CHS基因對黃酮類代謝物質含量、組成的影響，進一步分析黃酮類代謝物質變化對白三葉化感作用帶來的影響，闡述黃酮類物質和植物化感作用之間的關系。