長江口濕地氮施加對海三棱藨草生長及生理特性的影響

張 騫，李秀珍，張運清，孫香麗，徐 艷，閆中正

（華東師范大學河口海岸學國家重點實驗室，上海200062）

1 引言

海三棱藨草（Scirpusmariqueter）是莎草科（Cyperaceae）藨草屬（Scirpus）的多年生草本植物，是由唐進和汪發纘于1961年聯合發表的一個新雜交種，僅分布于我國東部沿海地區，主要集中在上海南匯、金山、奉賢、崇明三島、九段沙以及江蘇省啟東市的潮灘濕地潮間帶［1］。海三棱藨草是中國特有種，同時也是潮灘濕地上典型的先鋒物種，在崇明東灘、九段沙等地由其形成的海濱天然草場，可以為鸻鷸類、雁鴨類、鶴類、鷗類等多種國家級保護候鳥提供越冬及天然的覓食、活動、休憩場所［2］。由于之前人們對海三棱藨草的生態價值及功能缺乏必要的了解，因此在對潮灘濕地開發和應對外來物種入侵的過程中未能給予足夠的保護。目前，海三棱藨草的生存已受到嚴重的威脅。

氮元素是影響植物生長發育的重要因素之一。土壤氮素適宜時，植物生長旺盛，生物量增加；氮素含量過剩時，植物生長受到抑制、病蟲害抵抗力下降、且往往伴隨發育不良［3-4］。Cruz等［5］人對木薯（Manihotesculentacrantz）葉的氮添加試驗表明，適量的氮水平能夠增加植物體內的葉綠素、有機質含量，增強滲透調節能力及呼吸作用；曹健等［6］人對氮素添加量和烤煙（Nicotianatabacum）植物各器官元素含量的影響進行研究表明，在一定施氮范圍內，各器官含氮量均隨施氮量的增加而升高；李亞靜等［7］人通過對兔眼藍漿果（VacciniumasheiReade）施加不同濃度氮肥，發現施氮量過多會導致其產量下降、生長不良和凍害嚴重。

目前，氮過剩已成為長江口的主要環境問題之一［8］：唐洪杰在對長江口水域富營養化近30年變化的研究中發現，長江口水域無機氮年均濃度由20世紀80年代初期的4μmol·dm-3左右迅速增加到21世紀初期的26μmol·dm-3左右，已超過國家二類海水水質標準［9］，并引發東海赤潮的年年發生。海三棱藨草作為長江口潮灘濕地的主要鹽沼植被類型之一，氮素濃度過高對其生長的影響尚待研究。因此，為了探究不同氮濃度對海三棱藨草生長及生理特性指標的影響，精確評估海三棱藨草在不同程度氮過剩條件下的吸收凈化能力，本研究于2015年在崇明東灘以海三棱藨草群落為研究對象，通過外源添加不同濃度的氮，模擬不同土壤氮素環境對海三棱藨草生長和生理特征的影響，以期為富營養化背景下對海三棱藨草的種群保護提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 研究區概況

崇明東灘鳥類國家級自然保護區（121°50′～122°05′E，31°25′～31°38′N），位于長江入海口，是我國重要的潮灘濕地，也是海三棱藨草的主要分布區之一。保護區地處中亞熱帶北緣，屬海洋性季風氣候，溫和濕潤，年平均日照時數為2137.9h，無霜期長達229d；年平均氣溫為15.3℃，1月平均氣溫最低，為2.8℃，7月月均溫最高，為27.5℃；降水充沛，年降水量1022mm，主要集中在4-9月份，占全年降水的71%，相對濕度82%［10］。土壤類型為潮灘鹽土，適宜鹽生化草本植物群落的自然生長［11］。

2.2 試驗設計

試驗于2015年3月植株萌發期，在崇明東灘東旺沙海三棱藨草單一種群內開展。選取長勢相近的植株，設置大小為1m×1m的樣方，樣方之間間隔2m以上。樣地土壤全氮含量約50mg·kg-2，據此設置1，2，4，8倍土壤全氮含量的外源氮素，以不施加外源氮素的樣方為對照組，總共5組處理，每組樣方設置3個重復，氮素施加濃度分別為0，50，100，200和400mg·kg-1（以 N0，N1，N2，N3和 N4表示）。以尿素（含氮46.3%）作為施氮肥料在低潮位時人工施入，每月1次，共6次；在施氮后210天采集土壤和植物樣品，現場測量株高、植株密度等生長指標；功能葉片采樣后迅速放入裝有冰袋的保溫箱中，帶回實驗室立即放入液氮速凍。由于潮灘地區潮汐作用強烈，施加的氮素勢必受潮汐影響而濃度降低，因此參考土壤全氮含量來表征樣方內氮素水平（表1）；使用環刀采集表層30cm深度土壤樣品，在樣方內采用5點采樣法，現場混合裝入自封袋，帶回實驗室做進一步分析。

表1 各施氮水平樣方內土壤全氮含量Table 1 Soil total nitrogen content under different nitrogen addition levels

2.3 指標測定

2.3.1 地上、地下生物量 地上生物量：在野外將樣方內的植株地上部分齊根割取，帶回實驗室用蒸餾水沖洗干凈，105℃殺青2h并烘干至恒重，稱重后得到地上生物量（g·m-2）。

地下生物量：考慮到海三棱藨草為潮灘先鋒植物，根系較淺，因此樣方內割取掉地上部分后，用鐵鍬挖取20cm×20cm×20cm的土塊，沖洗至沒有泥土，僅殘留有植物根系，之后的測量方法與地上生物量相同。

2.3.2 土壤、植物氮素含量 采集的土壤樣品帶回實驗室，用上述方法殺青并置于50℃烘箱內烘干至恒重，后用木錘將大塊土塊敲碎，再經研磨后過100目篩網，用VarioIII元素分析儀（德國ELEMENTAR公司）對土壤全氮含量進行測定。

植物樣品將地上、地下部分分開，帶回實驗室用蒸餾水沖洗干凈，105℃殺青2h，之后放入烘箱于65℃烘干至恒重，后續操作與土壤氮素測定相同。

根據地上、地下的生物量和植物全氮濃度，可以計算各施氮水平下植株的氮儲量：植物氮儲量（g·m-2）= 地上生物量（kg·m-2）×地上部分全氮濃度（g·kg-1）+ 地下生物量（kg·m-2）×地下部分全氮濃度（g·kg-1）。

2.3.3 葉綠素含量測定 采用丙酮乙醇混合液法［12］，取約0.05g成熟葉片，用剪刀剪碎后放入試管并加入10mL丙酮、乙醇混合液（丙酮∶無水乙醇：水=4.5∶4.5∶1），保證葉片與提取液充分接觸，密封后置于避光處3天，待葉片完全變白時將提取液用分光光度計于OD645，OD663處檢測吸光度，根據Arnon公式［13］計算樣品的葉綠素含量。

其中V表示提取液最終體積（mL），W表示樣品鮮重（g），葉綠素濃度單位為mg·g-1FW。

2.3.4 丙二醛（MDA）濃度測定 丙二醛（MDA）作為膜質過氧化的最終產物，其濃度可用來表征植物的受脅迫程度和衰老程度［14］。本研究采用硫代巴比妥酸法測定植物葉片中的 MDA含量［15］。具體方法如下：取約0.2g成熟葉片剪碎放入研缽中，加入5mL 10%的三氯乙酸溶液（TCA）在冰浴環境下充分研磨，移至試管中，在高速帶溫控離心機內于9000rpm，4℃條件下離心5min。取1.5mL上清液加入1.5mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液（TBA）（溶解于10%TCA溶液中），于沸水浴中反應15min后迅速轉移到冰浴中冷卻，并于6000rpm，25℃條件下離心5min，取上清液用分光光度計于OD532，OD600，OD450下測定吸光度，并按照以下公式計算樣品MDA濃度（單位：μmol·g-1FW）

CMDA=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450

2.4 數據分析

本文采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）對不同施氮水平的植株高度、植株密度、生物量、全氮含量、葉綠素和MDA濃度等指標進行差異顯著性檢驗（α=0.05）。分析前先對數據進行正態分布、方差齊性檢驗，對不符合方差齊性的數據進行對數轉換。所有數據統計分析均在SPSS 18.0統計軟件中進行處理，圖表數據為平均數±標準差，采用Origin 8.0作圖。

3 結果與分析

3.1 施氮對海三棱藨草生長特征及生物量的影響

不同施氮水平對海三棱藨草生長發育影響顯著。隨施氮水平的增加，海三棱藨草株高、密度及生物量均呈現先增加后降低的規律（圖1），且變化存在顯著性差異：植株高度在N2處理下呈現最高值（76.7±7.8cm），與 N1，N3處理無顯著差異，相比無施氮處理N0升高近35%，后隨施氮水平的增加而降低；植株密度在N1處理下最高，為298.3±50.1株·m-2，與N2，N3，N4處理無顯著性差異，相比N0增加近51%；總生物量在N3處理時達到最高值525.6±33.6g·m-2，與N2處理無顯著差異，相比N0增加近40%。各施氮濃度下海三棱藨草的根冠比均在0.71±0.07范圍內，無顯著性差異（表2）。

圖1 不同施氮水平對海三棱藨草植株高度、植株密度和生物量的影響Fig.1 Plant height（A），density（B）and biomass（C）of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

表2 各施氮水平樣方內植物根冠比Table 2 Root/shoot ratio under different nitrogen fertilizer rates

綜合考慮各生長指標，在長江口潮灘濕地環境下，生境中氮素含量達到約N2，N3處理（施氮100，200mg·kg-1）水平時，最適宜海三棱藨草的生長，且高度、密度及生物量等指標均達到較高水平；若氮素含量繼續升高，海三棱藨草的生長則受到抑制，各指標停止增長并出現下降趨勢。

3.2 施氮對海三棱藨草含氮量的影響

隨施氮水平增加，海三棱藨草地上、地下部分的全氮濃度均高于對照組N0（圖2），且存在顯著性差異。其中，地上部分全氮濃度逐漸升高，在N3處理（施氮200mg·kg-1）達到最高值13.1±0.46 g·kg-1，相比N0增長約30%，N4處理（施氮400 mg·kg-1）不再增高且與N3處理無顯著差異；地下部分全氮濃度隨施氮水平的增加而增加，在N4處理時達到9.61±1.26g·kg-1，相比對照組增加約52%。

海三棱藨草的植株氮儲量隨施氮水平增加呈先增后減的變化趨勢（圖3）。且地上、地下變化趨勢相似，均在N3處理時達到最高儲量，此時植株總氮儲量為5.9g·m-2，相比無施氮處理增加約85%。

3.3 施氮對海三棱藨草生理特征的影響

海三棱藨草葉片中葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素的濃度隨施氮水平的增加呈先增加后停止增長的趨勢（圖4）；并在N3處理下達到最高值，但與N1，N2和N4處理無顯著性差異，相比無施氮處理葉綠素a提高約36%，葉綠素b提高約39%，總葉綠素提高約37%。

圖2 不同施氮水平對海三棱藨草植株全氮濃度的影響Fig.2.Total nitrogen concentration of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

圖3 不同施氮水平對海三棱藨草氮儲量的影響Fig.3Nitrogen reserves of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

本試驗中，海三棱藨草葉片丙二醛（MDA）濃度隨施氮水平的增加先降低后緩慢升高（圖5），MDA濃度在N1處理達到最低值0.93±0.08 μmol·g-1，相比 N0處理降低約26%，與 N2，N3，N4處理無顯著差異。

圖4 不同施氮水平對海三棱藨草葉綠素濃度的影響Fig.4 Chlorophyll content of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

圖5 不同施氮水平對海三棱藨草MDA濃度的影響Fig.5 MDA content of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

4 討論

目前，判斷元素對植物生長的影響主要通過與正常生長特征指標（對照組）進行對比。本研究中，隨著氮素添加濃度的升高，海三棱藨草在株高、密度和生物量等方面呈先增加后降低的趨勢，但均高于或與對照組無顯著差異，說明長江口的氮過剩環境會顯著促進海三棱藨草的生長發育，并在短期內不會受到氮抑制。前人研究認為，外源氮素的輸入將促進植物細胞伸長，從而提高植物的長勢［16］；在本試驗中，外源氮在0～100mg·kg-1范圍內時，海三棱藨草株高有顯著增長，但超過該范圍后，株高停止增長并在400mg·kg-1施氮水平下顯著下降（圖1）。說明在長江口潮灘濕地環境下，施加外源氮素達到約100mg·kg-1時，對海三棱藨草長勢的促進效果達到最佳，濃度繼續升高將無法起到促進效果，甚至抑制植物個體的生長。楊宇等［17］人在草原生態系統的氮添加試驗中發現，氮素的施加對植物分蘗沒有明顯的影響，但會降低植株的死亡率，從而可在一定程度上提高種群密度；在50mg·kg-1的施氮處理下海三棱藨草種群密度有顯著增加（圖2），但施氮量超過50mg·kg-1后，海三棱藨草群落密度停止增加并在施氮超過200mg·kg-1后顯著降低，這表明高濃度氮素對該種植物生長產生脅迫作用，致使種群密度下降［18］。

根冠比可以反映植物地下與地上部分的相關性，在氮素充足時，大部分氮素與光合產物用于地上部分生長，供應根部的比例相對較小，根冠比低［19］；但在本研究中，各施氮水平下海三棱藨草的根冠比未出現顯著性差異（表2），原因可能在于海三棱藨草特殊的球莖繁殖模式，導致在養分充足時，地上部分會將一定養分轉入地下形成地下球莖，經休眠后在第二年發育出新的植物個體［20］，因此減少了地上部分的生物量并增加到地下，致使海三棱藨草地下生物量隨氮素增加產生顯著性差異，從而減小了各施氮濃度下根冠比的差異，并造成地下生物量在不同氮濃度下的顯著差異（圖3）。

氮元素是葉綠素的主要組分之一，葉片中約75%的氮元素儲存在葉綠素中［21］；氮素濃度的大小強烈影響著植物組織的結構，從而影響到葉片光合功能。葉綠素含量增加后，植物需通過改變形態性狀（株高增高、生物量增加）和群落特征（植株密度增加）來保持其生理過程的穩定［22-23］。本研究中，氮添加濃度較低時，葉綠素含量的增加可能是一種植物的保護性反應，通過增加天線色素在捕光色素復合體中的比例，從而促進了植物的光合效率，也增強了對弱光的利用率，這與前人的相關研究結果一致［24-25］；而當施氮水平超過50mg·kg-1后，過高的氮素含量加快了植物的生命活動、同時推進其衰老進程，從而阻礙了葉綠素濃度的有效積累［26-27］，導致葉片葉綠素濃度不再顯著升高（圖4）。

丙二醛濃度的增加是植物細胞受損的直接表現，較高的丙二醛濃度說明組織的保護能力減弱，植株衰老速率加快［28］。本研究中，施氮處理的海三棱藨草葉片MDA濃度均低于無施氮處理，說明長江口的海三棱藨草在自然條件下便處于一種較高脅迫的狀態，這主要是源于潮灘濕地較高的土壤鹽度和較強的潮汐作用。不同濃度的施氮水平對葉片MDA濃度也有著非線性的影響：其中以N1處理（施氮50mg·kg-1）最低（圖5）；這說明在一定的濃度范圍內，環境中氮素濃度的增加會緩解葉片膜脂過氧化，減緩老化過程，但過高的氮素濃度可能會加劇過氧化反應，使海三棱藨草提前衰老，這與廖德志等人對榿木（Alnus formosana）的氮添加試驗結論一致［30］。

潮灘植物在生長過程中主要通過吸收并在植物體內固定氮元素，從而達到對環境中氮的凈化，因此植物體的氮儲量可作為衡量潮灘植物吸收和凈化能力的重要指標。植物的氮儲量主要由氮濃度和生物量共同影響，本研究中，植物地上和地下部分的氮素濃度隨施氮水平的增加均有顯著提高（圖2），且在添加濃度達到200mg·kg-1時植物氮素濃度達到最高，而400mg·kg-1的氮添加水平下，植物體內氮素濃度仍處于較高水平，說明海三棱藨草在氮素濃度較高的環境下會保持較高的吸收能力。同時，由于生物量隨施氮濃度增加而出現顯著的先升后降趨勢（圖1c），植物總的氮儲量也呈現出顯著的先升后降趨勢，并于200mg·kg-1施氮濃度下達到最大氮素儲量（圖3），超過該范圍后，海三棱藨草的總氮儲量會下降，對氮素的吸收和凈化能力也將隨之降低。目前崇明東灘海三棱藨草群落帶土壤全氮水平約為50mg·kg-1，尚未達到抑制海三棱藨草生長的程度，因此海三棱藨草仍可在長江口富營養化加劇的背景下較好地生長發育，并發揮其氮素吸收和凈化功能。

5 結論

（1）隨施氮濃度的增加，海三棱藨草的生長總體呈低濃度促進、高濃度抑制的規律。其中100～200 mg·kg-1的氮素施加量顯著提高了海三棱藨草的各項生長指標和葉片葉綠素含量，相比無施氮處理，植株高度提高約35%；植株密度提高約50%；總生物量提高約40%；葉片總葉綠素濃度提升約37%。

（2）海三棱藨草植株的氮儲量在施氮200mg·kg-1處理時達到最大值5.9g·m-2，超過該水平后，氮儲量顯著降低，對氮素的吸收和凈化能力逐漸減弱。

（3）目前長江口潮灘濕地的土壤全氮含量尚未達到抑制海三棱藨草生長的水平，氮過剩環境有利于該植物的生長發育，并可以較好地發揮其氮素吸收和凈化功能。