引進紅三葉種質資源遺傳多樣性的ISSR分析

柴繼寬，趙桂琴，孟麗娟

（甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070）

紅三葉（Trifoliumpratense）是豆科蝶形花亞科三葉草屬多年生草本植物，又名紅車軸草、紅花荷蘭翹搖、金雀菜等［1］，壽命較長，一般可以生存5～8年，甚至10年以上［2］。紅三葉草質柔軟，葉量豐富，品質優良，營養價值高，各種家畜均喜食［3］。此外，紅三葉也因含有大量的異黃酮等物質而頗受保健品和醫藥產品市場的青睞［4］。

我國紅三葉種質資源比較匱乏，野生種僅見于新疆、貴州、云南等地［5］。上世紀70年代從美國、新西蘭和歐洲引進了一批紅三葉優良品種，目前在生產中使用的已經很少。我國在紅三葉方面的研究主要側重于栽培技術［6］，營養價值［7］，轉基因［8］，異黃酮含量［9］以及高富硒能力［10］等方面。有關刈割時間、次數［11］對紅三葉再生草生物學特性的影響以及施氮、磷肥和緩釋復合肥［12］對紅三葉營養元素含量、草產量和品質效應方面的報道也比較多。

到目前為止，通過全國草品種審定委員會等級的紅三葉品種只有4個，且都是地方品種。生產中使用的紅三葉品種主要來自國外。對引進品種的深入研究是進一步利用的基礎。由于地域差異，引進種質有時會表現出優異的特性［13］，但受環境條件的影響比較大。同一基因型在不同環境條件下表現不同，而相同的表型又可能具有不同的基因型［14］。紅三葉是異花授粉植物，單純通過表型性狀來研究其遺傳關系以及進行種質篩選，可靠性比較低。在研究多樣性時，不僅要分析形態特征如外觀、葉型、株高、莖色、熟期等方面的差異，還需要分析其遺傳背景。因此，應用現代分子生物學技術尤其是分子標記技術對紅三葉的遺傳多樣性和親緣關系進行研究顯得尤為重要。

通過分子標記不僅可以了解到植物遺傳背景信息，還可以深入研究其遺傳多樣性，可靠性比較高［15］。ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子標記技術是一種基于PCR的新興DNA分子標記技術。與其他分子標記相比，ISSR分子標記具有很大的優越性，如試驗操作簡單、成本低、快速靈敏、穩定性高、所需DNA量少等［16-17］，而且不需要預先知道研究對象的基因組序列，大大減少了多態性分析的預備工作。近年來，ISSR分子標記在牧草種質資源的鑒定與評價中已經得到了廣泛應用。在苜蓿（MedicagoSativa）［18］、羊茅（FestucaOvina）［19］、雀麥屬（Bromus）［20］和鴨茅（Dactylis）［21-22］等種質資源遺傳多樣性研究方面均有報道。三葉草方面的研究主要集中于白三葉。Sharmas等［23］利用形態學和RAPD分子標記對引進白三葉品種遺傳多樣性進行了分析；George等［24］利用SSR標記檢測了不同產地白三葉品種的遺傳多樣性。國內李潤芳［25］等、張婧源［26］等利用SRAP技術對白三葉種質資源的遺傳多樣性進行了研究。紅三葉方面，Dias等［27］利用形態學和SSR分子標記對來自35個國家的80份紅三葉的遺傳多樣性進行了分析；Camposs等［28］利用RAPD分子標記對4組紅三葉優異親本材料遺傳多樣性進行了分析；Herrmann等［29］對紅三葉AFLP反應體系進行了優化并對紅三葉野生種和栽培種的遺傳多樣性做了分析；Paplauskiene等［30］利用ISSR-PCR分子標記研究紅三葉品種的遺傳變異。目前國內利用ISSR標記研究紅三葉遺傳多樣性尚未見報道。

本研究擬利用ISSR分子標記技術，從DNA分子水平上分析31份國外引進紅三葉種質間的親緣關系和遺傳多樣性狀況，旨在為紅三葉種質資源的評價及合理利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為來自俄羅斯、加拿大和美國的31份紅三葉種質材料（表1），均按10m2（2m×5m）的小區種植于甘肅省中部的榆中縣良種場；于分枝期取樣，每份材料隨機取30個單株，從每個單株上采集基部剛展開的新葉2～3片，置于-80℃冰箱內保存。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法［31］提取紅三葉葉片總DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，并用Gene Spec核酸檢測儀檢測DNA質量濃度。最后將樣品稀釋為20ng·μL-1，-20℃保存備用。

表1 試驗材料及來源Table 1 The materials and their source

1.3 ISSR引物篩選

基于ISSR 標記在苜蓿［18］、扁蓄豆（Pocockia ruthenia（L.）Boiss.）［32］、豬屎豆（Crotalariamucronata）［33］等豆科植物的研究報道。本研究ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）提供的100個ISSR引物序列，選出20個引物進一步篩選用于紅三葉ISSR-PCR反應，由上海生物工程有限公司合成。

1.4 ISSR-PCR擴增及電泳檢測

利用正交設計，從4個水平上對影響ISSRPCR反應體系的主要因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物）進行篩選與優化，建立了重復性好、反應穩定的紅三葉ISSR-PCR反應體系。即25μL反應體系中，包含40ng模板DNA，10×PCR-buffer 2.5μL，2.5mmol·L-1Mg2+，2.5U Taq DNA聚合酶，引物1μmol·L-1，0.2mmol·L-1dNTP。擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，引物退火30s，72℃延伸1min，循環35次；72℃延伸7min，4℃保存。

PCR擴增完成后，取8μL擴增產物在1.7%的瓊脂糖凝膠上電泳，用DM2000作標準分子量對照，在1×TBE緩沖液中電泳約1h（電壓為100 V），檢測后置于UVP紫外凝膠成像系統中觀察拍照。

1.5 數據分析

根據電泳圖譜中清晰可辯的擴增條帶在同一位置上的有無記數，有記為“1”，無記為“0”，統計PCR擴增產物的條帶總數和多態性條帶數。計算多態性位點比率P=i/j×100%，式中i為多態性位點數目，j為統計出的位點總數。用POPGEN1.32軟件計算多態位點百分率（PPB）、Nei基因多樣性指數（H）、有效等位基因數（Ne）和Shannon多樣性信息指數（I）。用軟件NTYSYS-PC 2.10e計算遺傳相似系數（genetic similarity）GS=2Nij/（Ni+Nj），式中，Ni和Nj分別為i和j兩材料的擴增條帶數，Nij為i和j兩材料共有的擴增條帶數。根據GS值按非加權配對算術平均法（UPMGA）進行聚類分析，建立聚類圖。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的質量檢測

將提取的31個供試材料的基因組DNA的質量進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。31份紅三葉種質的基因組DNA都呈現清晰、可辨譜帶，無降解現象，無彌散的熒光出現，加樣孔清晰，同時無RNA和其他非特異性DNA片段污染，因此保證了供試材料DNA進行ISSR分析的有效性和準確性。

圖1 31個紅三葉品系基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genetic DNA for 31red clover accessions

2.2 ISSR引物篩選及擴增條帶的多態性

利用兩個表型差異較大的材料對20個ISSR引物進行篩選，淘汰擴增效果差、帶型不易辨認的引物，最終篩選出5個條帶清晰、穩定性和重復性好且相對條帶較多的引物（表2）。利用這5個引物對所有31份紅三葉種質基因組DNA進行ISSR擴增，共擴增出61個DNA片段，其中多態性帶58個，多態性比率高達95.08%。單條引物擴增出的清晰條帶數在8～20條之間，平均每條引物擴增出11.6條多態性條帶，其中引物850最多擴增出20條多態性條帶；引物848最少能擴增出4條多態性條帶。擴增出的DNA片段集中在150～2000bp之間。其中，多態性百分率最高的為引物849，850和851，均為100%；最低的為引物841，為75%。可見ISSR檢測紅三葉種質資源遺傳多樣性的效率很高，也表明紅三葉種質在分子水平上的遺傳多樣性是比較豐富的。引物851對31份紅三葉種質基因組DNA的擴增結果如圖2所示。

表2 供試材料的ISSR引物及擴增結果Table 2 Primers used in ISSR and amplification results of tested materials

圖2 UBC851對31份紅三葉種質的ISSR擴增結果Fig.2 The amplification result of UBC851ISSR marker

2.3 遺傳多樣性分析

等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon多樣性信息指數（I）和Nei’s基因多樣性指數（H）都是衡量遺傳多樣性水平的常用指標。有效等位基因數（Ne）和Nei’s基因多樣性指數（H）是目前應用較為廣泛的遺傳多樣性指數，具有明顯的遺傳學意義。Shannon多樣性信息指數（I）本身沒有遺傳學意義，但方便與同類研究進行比較［34］。通過 POPGENE1.32軟件分析，結果表明，31份紅三葉種質材料的平均Na，Ne，H和I值分別為1.9508，1.3162，0.2092 和0.3427（表3）。

表3 31份紅三葉種質材料遺傳多樣性指數Table 3 Genetic diversity indexes of 31red clover germplasm

2.4 遺傳相似性分析

遺傳相似系數是用來比較群體或個體間相似程度的度量參數，遺傳相似系數值越大，說明材料間相似程度越大，遺傳背景一致性越強［35］。利用5個引物產生的標記信息，經POPGENE1.32分析軟件計算31份紅三葉種質間的遺傳相似系數（GS），得到供試材料相似系數矩陣（表4）。遺傳相似系數值越大，說明材料間的親緣關系越近，反之，親緣關系越遠。由表4可知，31份紅三葉種質的遺傳相似系數在0.5902～0.9344之間，平均遺傳相似系數為0.7840。從表4可以看出，1號和2號、5號和6號、17號和18號種質之間的遺傳相似系數最大（0.9344），說明他們之間的親緣關系最近，遺傳差異相對較小；16號和31號之間的遺傳相似系數最小（0.5902），說明二者的親緣關系最遠，遺傳差異相對較大。

表4 ISSR標記的31份紅三葉材料之間的遺傳相似系數Table 4 Genetic similarity coefficient of 31red clover germplasm based on ISSR

2.5 聚類分析

為了確定各供試材料間的遺傳關系，通過NTSYS-PC 2.10e軟件，以31份紅三葉種質材料和61個位點的譜帶數為原始矩陣，利用非加權平均距離法（UPGMA）進行聚類分析，構建31個紅三葉種質間的遺傳關系聚類圖（圖3）。從圖3可以看出，供試材料以遺傳相似系數0.806為閾值可以將31份紅三葉種質聚為5類。第Ⅰ類由來自俄羅斯的10份紅三葉種質材料組成；第Ⅱ類包括11份種質材料，其中有來自俄羅斯的9份種質和加拿大的2份種質；第Ⅲ類由來自加拿大的2份紅三葉種質組成；第Ⅳ類是來自加拿大的24號種質；第Ⅴ類包括7份種質材料，包括加拿大的2份種質和美國的5份種質。

3 討論與結論

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，是每種生物所固有的特性，也是其生存、發展和進化的基礎［36］。一個種群遺傳多樣性越高或越豐富，在環境發生變化時生存下來的可能性就越大，越容易擴展其分布范圍和開拓新環境，可見物種或種群進化潛力和適應環境的能力取決于遺傳多樣性的大小［37］。分子標記能從DNA水平上檢測遺傳變異，是進行物種遺傳多樣性、分類和親緣關系分析等方面研究的有力工具。ISSR標記是一種基于PCR的分子標記，結合了RAPD標記技術和SSR標記技術的優點，大多為顯性標記，符合孟德爾遺傳規律，多態性很高，而且引物具有通用性，可以在多種植物中通用［38-39］，是一種重復性好、效率高的分子標記，近年來在遺傳多樣性分析領域被廣泛應用［40-41］。ISSR比RAPD能檢測到更多的信息位點，更適用于紅三葉的遺傳多樣性分析。本研究利用ISSR技術對31份紅三葉種質的遺傳多樣性進行分析，從20條ISSR引物中篩選出5條多態性高、反應穩定的引物，共擴增出61條帶，平均每條引物能擴增出12.2條帶，其多態位點百分率（P）高達95.08%，Shannon信息指數（I）為0.3427，有效等位基因數（Ne）為1.3162，Nei’s基因多樣性指數（H）為0.2092，都反映出紅三葉種質很高的遺傳多樣性。

圖3 31份紅三葉種質基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 31red clover germplasm

從相似系數看，31份紅三葉種質的遺傳相似系數分布在0.5902～0.9344之間，表明紅三葉的遺傳多樣性是比較豐富的，這與Ulloa等［42］利用RAPD標記技術的研究結果相似。這種多態性將為紅三葉種質資源異地保存、鑒定、適應性評價以及生態型研究奠定可靠、穩定的基因基礎。基于ISSR標記，31份紅三葉種質材料以遺傳相似系數0.806為分類界限，可以聚為5大類。從聚類圖上看，大多數來源地相同的紅三葉種質資源聚在一起，如第Ⅰ類的材料全部來自加拿大，說明其親緣關系較近；李紅等［43］在研究苜蓿遺傳多樣性時也得到了相似的結論，即來自不同地區的種質，大部分可按地理來源聚為一類。但也存在部分同一來源地的種質間遺傳相似系數差異較大無法聚為一類的情況，如來自加拿大的24號種質材料單獨聚為一類。與其他種質材料的遺傳距離較遠，這與其獨特的表型相符，24號種質材料具有葉片大、再生速度快、干草產量高等優異特性。

作者對31份紅三葉種質的形態特征和農藝性狀也進行了研究［44］，發現來自美國的材料葉片大、節間長、干草產量高、再生速度快、種子千粒重；俄羅斯的種質普遍分枝數多、葉片小、節間短、干草產量較低、種子也較小。根據形態特征的聚類結果把31個紅三葉種質分成4類，表現優良的23號和24號種質聚為同一類。ISSR分子標記將31份紅三葉種質在遺傳相似系數0.806處聚為5類，24號種質材料單獨聚為一類，與其他材料遺傳距離較遠。雖然兩種聚類分析都可將大部分地理來源相近的種質聚在一起，但ISSR標記聚類的結果與基于形態特征聚類的結果仍然存在一些差別。這可能是由于ISSR標記體現的是種質材料間分子水平上的差異，而表型性狀的差異是基因與環境共同作用的結果，因此，檢測出的遺傳差異并不都與所觀測的表型差異相一致。作為傳統分類的補充，ISSR分子標記可減少由形態描述和環境條件產生的誤差，從分子水平鑒定種質資源之間的差異［45］，不受取材、時間及人為等因素的影響［46］，更容易把不同的種質材料區分開。因此，ISSR標記在一定程度上能更本質地反映出紅三葉種質資源間親緣關系的遠近。在實際應用中可將ISSR分析結果直接應用于品種選育，選擇遺傳距離較大、親緣關系較遠的材料做親本，以增加后代的遺傳重組，提高雜種優勢。