不同程度冠狀動脈損傷E-選擇素基因多態性研究

王麗萍 孫常銘 于海明 朱金伶 李欣欣 華正祥

·論著·

不同程度冠狀動脈損傷E-選擇素基因多態性研究

王麗萍 孫常銘 于海明 朱金伶 李欣欣 華正祥

目的研究E-選擇素血清學水平及其第2外顯子G98T和第4外顯子A561C基因多態性與不同程度冠狀動脈損傷的相關性。方法選取2015年1月至2017年3月診治的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者及其同期健康體檢者為研究對象，采用雙抗體夾心方法檢測冠狀動脈粥樣硬化型心臟病組和對照組可溶性血清E-選擇素水平，并對不同亞組及其基因型間血清E-選擇素水平介導白細胞的滲出對178例冠心病患者和162例健康對照者的E-選擇素基因多態性分布情況采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法(PCR-RFLP)進行分析。結果冠心病組E-選擇素血清水平顯著高于對照組 (P<0.01)；冠心病亞組可溶性E-選擇素血清水平比較差異有統計學意義(P<0.01)；冠心病3組組間比較，AMI組E-選擇素血清水平較SA組高，差異有統計學意義(P<0.05)，但UA、AMI組比較差異無統計學意義(P>0.05)；冠心心病組中E-選擇素 G98T基因型GT基因型與GG基因型比較差異無統計學意義(P>0.05)；A561C基因型比較發現AC基因型E-選擇素空腹血清學水平高于AA基因型者(P<0.05)；E-選擇素 G98T在急性心肌梗死組和心絞痛組間GT與GG基因型的分布差異有統計學意義(χ2=4.030，P<0.05)， GT基因型患急性心肌梗死的風險是GG基因型的2.356倍(OR=2.356，95%CI=1.020～5.442 )。A561C在急性心肌梗死組和心絞痛組間AC與AA基因型的分布差異有統計學意義(χ2=5.426，P<0.05)，AC基因型患急性心肌梗死的風險是AA基因型的2.558 倍(OR=2.558,95%CI=1.160～5.641)。結論不同程度冠狀動脈損傷影響E-選擇素基因多態性，E-選擇素 G98T 和A561C基因多態性與冠心病發病有相關性，并可影響血清E-選擇素水平。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟??；E-選擇素;基因多態性

disease;E-selectin;gene polymorphism

冠狀動脈性疾病是發達國家和發展中國家共同存在的危害人類健康的頭號殺手之一，近幾年來已成為醫學研究、臨床醫生關注的焦點。據世界衛生組織估計，在中國每年有近700 000多人死于該疾病。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是臨床最常見的慢性心臟疾病，是全球人類死亡的主要原因之一[1]。冠心病的病理基礎主要是冠狀動脈發生粥樣硬化所致。大量證據表明，炎性反應既可促進冠心病的發生，又可導致冠狀動脈血栓形成甚至閉塞，冠狀動脈斑塊內的炎性反應在冠心病血栓形成中起重要作用[2]。E-選擇素作為選擇素家族中的一份子，是近年來新發現的一種炎性細胞因子，在炎癥形成過程的早期出現，它在動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中起重要作用。目前已經鑒定出一些冠心病易感基因，近年來，冠心病的全基因組關聯研究的方法使冠心病易感基因的研究更加快速、可靠，同時有力地推動了冠心病遺傳學的發展。因而多方面研究冠狀動脈粥樣硬化性心臟病在基因發病機制的影響，進而為藥物研究、疾病防治和精準治療是有幫助的。本研究采用酶聯免疫吸附試驗檢測冠心病組和對照組血清E-選擇素水平，同時采用PCR-RFLP方法檢測E-選擇素基因多態性，旨在探討不同程度冠狀動脈損傷對E-選擇素基因多態性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中均選自2015年1月至2017年3月于承德醫學院附屬醫院心血管內科及老年病科診治的冠狀動脈粥樣硬化型心臟病患者(冠心病組)178例，其中男108例，女70例;平均年齡(61.20±12.27)歲。根據中華醫學會血管病分會制定的《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準(2010)》。納入標準：(1)患者在勞累后出現持續性1～5 min的胸后方疼痛，并放射在左上肢和肩部；(2)發病心電圖可見暫時的T波倒置或ST段下移；(3)經冠狀動脈造影可見動脈狹窄或阻塞程度>50%；(4)感染患者經實驗室檢測結果為陽性。同時又對以上研究對象分為下列亞組:(1)急性心肌梗死(AMI)組58例，男32例，女24例；平均年齡(60.20±11.27)歲；根據臨床癥狀，持續劇烈胸痛>30 min以上，十二導聯心電圖的動態演變，心肌標志物陽性確診，發病24 h以內。(2)不穩定型心絞痛(UA)組60例，男28例，女32例；平均年齡(61.03±10.47)歲；有靜息性心絞痛或近一個月內新發心絞痛，胸痛<30 min；心絞痛發作時間內，心電圖出現明顯的ST段缺血性壓低，范圍>1 mm，呈暫時性發作，癥狀緩解后，迅速恢復或接近正常；心肌標志物正常水平；并距離末次發作時間在24 h以內。(3)穩定型心絞痛(SA)組60例，男31例，女29例；平均年齡(60.86±11.46)歲；其表現在2個月內無明顯改變，運動試驗呈現陽性，并且有勞累性心絞痛發作史。UA組和SA組為心絞痛組。對照組162例，男92例，女70例；平均年齡(60.73±12.06)歲；為同一時期體檢科體檢人員隨機選取，心電圖檢查正常，無肝腎疾病、無心腦血管、內分泌等疾病。

1.2 納入標準 以上所有研究對象無血緣關系，所選病例無先天性心臟病、心肌病、心內膜炎；無嚴重肝臟、腎臟、呼吸系統疾病患者；無外惡性腫瘤、腦血管疾病、自身免疫性疾??；1年內未進行心臟介入手術等患者。所有受試者知情同意。

1.3 方法

1.3.1 全血基因組DNA提取:取EDTA 抗凝劑的外周靜脈血5 ml，用鹽析法提取基因組DNA，并置于-20℃冰箱保存。

1.3.2 引物設計與合成:PCR引物用Primer 5設計，引物由Thermo Fisher公司合成。引物序列如下：用于擴增E-selectin 第2外顯子 G98T基因多態性位點的一對引物：5′-TGCCCAAAATCTTAGGATAC-3′；5′-AAGCCCAGGGAAGAACACAT-3′；用于擴增E-selectin 第4外顯子A561C基因多態性位點的一對引物：5′-AGTAATAGTCCTCCTCATCATG-3′；5′-ACCATCTCAAGTGAAGAAAGAG-3′。

1.3.3 PCR擴增條件:PCR擴增反應體系為30 μl，其中基因組DNA 3 μl，正、反向引物各2 μl，Taq DNA聚合酶 0.5 μl，10×PCR buffer 3 μl，dNTPs 2 μl，MgCl22 μl，雙蒸水15.5 μl。以上產物混合后置熱循環儀上：預變性：95℃ 5 min；變性：95℃ 30 s；復性：58℃ 1 min；延伸：72℃ 1 min。共30個循環，最后72℃延伸12 min冷卻到4℃。

1.3.4 擴增產物的限制性酶切:取PCR擴增產物15 μl，G98T基因擴增產物用限制性內切酶HphI進行酶切，A561C基因擴增產物用限制性內切酶Pstl進行酶切。37℃孵育4.0 h反應結束后，用3%瓊脂糖凝膠對酶切產物進行電泳,用自動凝膠成像系統成像。

1.3.5 E-選擇素血清學水平測定:采用雙抗體夾心法檢測冠心病組和對照組血清E-選擇素水平。

2 結果

2.1 冠心病組與對照組血清可溶性E-選擇素水平比較 冠心病組與對照組比較，E-選擇素血清水平組間差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2 冠心病亞組可溶性E-選擇素血清水平比較 SA、UA、AMI 3組分別與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；冠心病3組組間比較，AMI組E-選擇素血清水平較SA組高，差異有統計學意義(P<0.05)，但UA、AMI組比較無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組別可溶性E?選擇素χ2值P值冠心病組(n=178)59．3±7．6對照組(n=162) 34．6±8．24．1260．032

組別可溶性E?selectin對照組(n=162)33．8±7．7SA組(n=60) 46．4±6．3?△UA組(n=60) 60．1±8．0?#AMI組(n=58) 69．2±7．2?#

注:與對照組比較，*P<0.05；與SA組比較，#P<0.05；與UA組比較，△P<0.05

2.3 不同基因型間E-選擇素血清學水平比較 冠心病組中E-選擇素 G98T基因型GT基因型與GG基因型比較差異無統計學意義(P>0.05)；A561C基因型比較發現AC基因型E-選擇素空腹血清學水平高于AA基因型者(P<0.05)。見表3。

表3 不同基因型E-選擇素血清學水平比較 μg/L

2.4 E-selectin基因G98T、A561C PCR產物酶切結果 E-Selectin第2外顯子 G98T PCR擴增產物片段長度為332 bp，用限制性內切酶Hphl酶切后可發現基因型有3種，GG型兩條帶(138 bp、194 bp)，GT型三條帶(194 bp、138 bp、332 bp)。E-selectin 第4外顯子A561C PCR擴增產物片段長度為186bp，用限制性內切酶Pstl酶切后發現基因型有3種方式，AA型兩條帶(123 bp，63 bp)，AC型三條帶(186 bp，123 bp，63 bp)。本實驗均未檢測到一條帶現象。見圖1、2。

2.5 AMI組與心絞痛組E-選擇素基因型比較

2.5.1 E-選擇素第2外顯子G98T在AMI組和心絞痛組間GT與GG兩個基因型的分布進行統計分析后顯示差異有統計學意義(χ2=4.028，P<0.05)；相對風險性統計分析結果表明，GT基因型患急性心肌梗死的風險是GG基因型患者的2.227倍(OR=2.227，95%CI=1.020～5.442)。見表4。

圖1 HphI限制性內切酶酶切G98T位點結果

圖2 Pstl限制性內切酶酶切 A561C位點結果

注：1：100～2 000 bpMarker；1～2 PCR產物；3～4為AA型兩條帶；5～6為AC型三條帶

2.5.2 E-選擇素第4外顯子A561C在AMI組和心絞痛2組比較，AC基因型與AA基因型的分布差異有統計學意義(χ2=5.368，P<0.05)；分布頻率的相對風險性分析結果顯示：GT基因型患者患急性心肌梗死的風險是GG基因型患者的2.368倍(OR=2.368,95%CI=1.160～5.641)。見表5。

表4 冠心病亞組E-選擇素 G98T基因型比較 例(%)

表5 冠心病亞組E-選擇素 A561C基因型比較 例(%)

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病指冠狀動脈粥樣硬化使冠脈血管內腔狹窄或阻塞，引起心肌缺血、缺氧，它和冠狀動脈痙攣一起統稱為冠狀動脈性心臟病[3]。冠心病患者主要癥狀是表現為胸前區壓榨性疼痛，常遷延至手臂、頸部及胃部，常由體力勞動或情緒激動所激發，發作時表現為心絞痛和不穩定性心絞痛，嚴重患者發作期可能誘發心肌梗死，患者由于心力衰竭而死亡。目前冠心病是世界上公認的發病率和病死率都很高的一類疾病，并且日益年輕化，這給人們的生活帶來了極大的負擔。國內外學者把冠心病看作是一種多風險因素，也就是說環境因素及遺傳易感基因共同的作用所導致了這類疾病的發生[4]。

動脈粥樣硬化斑塊的形成是冠心病的發病基礎，它是一種慢性炎癥性疾病，慢性炎癥加速了冠狀動脈粥樣硬化的發生發展。目前，對冠心病的病因的研究主要集中在以下兩個方面：從宏觀水平尋找疾病發生的危險因素和從微觀水平探討冠心病發病的遺傳基因，近幾年來對冠心病易感基因的研究是成為了眾多學者關心的熱點方向。冠狀動脈斑塊破裂隨之發生的血小板聚集和血栓形成也是導致冠狀動脈粥樣硬化發生的重要機制之一，75%的冠狀動脈粥樣硬化是不穩定斑塊所致。病理學研究表明，動脈粥樣硬化斑塊區有大量炎性細胞的浸潤，這多發生的部位在破裂斑塊的“肩區”以及脂質核心部位，這表明了炎性反應參與了冠狀動脈粥樣硬化的發生及發展的整個過程[5]。大量的研究結果表明，白細胞黏附因子是炎癥最早出現的一類因子，可作為動脈粥樣硬化的一個重要標記分子[6]，在單一部位或全身性炎癥疾病時，動脈粥樣硬化斑塊的形成起著至關重要的作用。

E-選擇素在結構上是由多種配體組成的，其中包括唾液酸化路易糖a、唾液酸化路易糖X和以及一些相關的寡聚糖等[7,8]。在靜息時刻，內皮細胞上含量不多，而當內皮細胞受炎性因子TNF-α、IL-1、細菌脂多糖(LPS)以及AngⅡ等因子刺激后，血清可溶性E-選擇素的水平表達急劇增加。經相關學者研究證實，組織發生炎性反應時會導致冠狀動脈粥樣硬化的斑塊發生表現出不穩定狀態，這也是急性心肌梗死發病的的主要因素之一[9]。血清可溶性E-選擇素是由黏附分子的胞外部分的酶裂解而來的，包括白細胞、血管內皮細胞或其他多種細胞的表面因子，裂解后的酶使胞外部分脫落進入血液循環導致了疾病的發生?？扇苄匝錏-選擇素介導白細胞的滲出，使白細胞緊密的黏附于內皮表面，同時黏附和聚集多種白細胞和T細胞及其亞群，而此種黏附聚集恰恰正是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要機制[10]。

相關研究表明E-選擇素可能參與了疾病的發生和發展，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的血清可溶性E-選擇素水平表達增加[11]。Guray等[12]做過類似報道，提示E-選擇素參與老年冠心病的發生發展。Foglieni等[13]發現與穩定型心絞痛比，急性冠脈綜合征的乳房內動脈內皮表達E-選擇素等炎性指標明顯增高。為了進一步研究E-選擇素基因型與冠心病嚴重程度的相關性，我們對試驗對象進行了分組，分為冠心病急性心肌梗死組及心絞痛組，結果顯示：在急性心肌梗死組和心絞痛組間GT與GG和 AC與AA基因型的分布均存在顯著性差異，這說明動脈粥樣硬化性心臟病的嚴重程度與E-選擇素基因型的分布密切相關。

研究表明，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者外周血中血清可溶性E-選擇素的水平升高程度與冠狀動脈粥樣硬化的病變程度呈明顯的相關性，血清可溶性E-選擇素水平可能在疾病的發生、發展過程與冠狀動脈粥樣硬化的形成中起重要作用[14]。國內學者田乃亮等[15]研究結果提示冠心病的sE-選擇素水平明顯增高，且在不同程度冠心病損傷程度上差異顯著，此研究說明血清E-選擇素水平的升高程度與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的病變程度有相關性，其水平的高低會影響的疾病的發生發展程度。研究發現在心肌梗死時給予E-選擇素等的單克隆抗體治療可以減少心肌梗死的范圍。同時我國學者楊立森等[16]也研究發現冠狀動脈粥樣硬化患者E-選擇素水平呈現升高的趨勢，并且升高的水平與疾病的嚴重程度正相關，這可作為鑒別胸痛患者懷疑冠心病的臨床輔助檢查手段之一。當然也有學者持不同意見。但也有一種觀點認為AMI和UA患者的血清可溶性E-選擇素水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，但相較SA組水平要高，相比較對照組水平也明顯增高。早期國外學者Blann等[17]研究報道，局部缺血性心臟病其可溶性血清E-選擇素水平呈現增高趨勢，這表明E-選擇素水平的增高是發生動脈粥樣硬化的危險因素之一。

本試驗研究結果表明：可溶性E-選擇素血清水平在冠狀動脈粥樣硬化患者組和對照組比較前者呈顯著增高水平，但在UA組、AMI組比較差異無統計學意義(P>0.05),這說明盡管UA和AMI的病情嚴重程度不同,但兩者冠狀動脈內皮細胞的激活程度是相當的。本試驗研究結果與Talar等[18,19]的研究結論大體上一致，以上結果也表明：冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的血清E-選擇素水平的升高表明了缺血心肌組織發生了急性炎性反應，可溶性血清E-選擇素水平可用于評價冠狀動脈粥樣硬化斑塊是否穩定及其穩定程度，這對于疾病的進展情況判定有重要鑒別意義。而目前對于E-選擇素基因型分分布是否影響E-選擇素血清學水平，目前尚無定論[20]。我們的研究結果顯示：在冠心病組中血清E-選擇素水平G98T基因位點比較差異無統計學意義(P>0.05),但A561C基因位點AC基因型高于AA基因型者，這提示E-選擇素第4外顯子A561C基因多態性在內皮細胞上的表達和基因結構相互關聯，其水平的高低會影響疾病的程度，同時也會引起蛋白質功能的變化導致冠心病的發生發展，這與國外著名學者田乃亮等[15]的E-選擇素基因型對血清E-選擇素水平有影響在理論上觀點是一致的。

綜上所述，血清可溶性E-選擇素水平在冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成過程中不同程度的表達，冠狀動脈損傷程度越嚴重，其表達水平越高，E-選擇素基因多態性分布與冠脈損傷程度也呈正相關趨勢，因此臨床上檢測可溶性E-選擇素血清學水平并且進一步研究基因多態性分布有助于判斷冠心病患者的病情程度及進展情況。而目前研究尚處于初級階段，因而還需要我們進行大樣本、多地域、多民族廣泛深入的協同研究。

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StudyonE-selectingenepolymorphismindifferentdegreeofcoronaryarterylesion

WANGLiping*,SUNChangming,YUHaiming,etal.

*DepartmentofBloodTransfusion,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollage,Hebei,Chengde067000,China

ObjectiveTo investigate the serum levels of E-selectin and the correlation between the second exon A561C and the fourth exon G98T gene polymorphism of E-selectin and different degree of coronary artery lesion.MethodsA total of 178 patients with coronary atherosclerotic heart disease who were diagnosed and treated in our hospital from Januaty 2015 to March 2017 were enrolled as coronary heart disease group (CHD group),meanwhile,the 162 health examination subjects were enrolled as control group.The E-selectin levels were detected by double antibody sandwich method,and E-selectin gene polymorphism distribution status was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).ResultsThe serum level of E-se1ectin in CHD group were significantly higher than those in control group (P<0.01). There were significant differences in serum soluble E-selectin levels among CHD subgroups (P<0.01).Among the three CHD groups,the serum levels of E-selectin in acute myocardial infarction (AMI) group were significantly higher than those in SA group (P<0.05),but there were no significant differences between UA group and AMI groups (P>0.05). In CHD group,there was no significant difference between G98T genotype,GT and GG genotype of E-selectin (P>0.05).The A561C genotype comparison showed that the fasting serum levels of E-selectin of AC genotype were significantly higher than those of AA genotype (P<0.05).There was significant difference in GT and GG genotype distribution in G98T genotype of E-selectin between AMI group and angina pectoris group (P<0.05),The risk of AMI in patients with GT genotype was 2.356 times as high as that of GG genotype (OR=2.356,95%CI=1.020～5.442 ).There was significant difference in the distribution of AC and AA genotype of A561C between AMI group and angina pectoris group (P<0.05).The risk of AMI in patients with AC genotype was 2.558 times as high as that of AA genotype (OR=2.558,95%CI=1.160～5.641).ConclusionThe different degree of coronary artery injury may affect E-selectin gene polymorphism,the G98T and A561C gene polymorphisms are correlated to pathogenesis of coronary heart disease,which may

also influence the serum levels of E-selectin.

coronary atherosclerotic heart

067000 河北省承德市，承德醫學院附屬醫院輸血科(王麗萍、華正祥)，檢驗科(孫常銘)；河北省平泉縣醫院檢驗科(于海明)；河北省灤平縣醫院檢驗科(朱金伶)；河北省寬城滿族自治縣醫院檢驗科(李欣欣)

華正祥，067000 河北省承德市，承德醫學院附屬醫院輸血科；

E-mail:78001625@qq.com

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.19.003

R 541.4

A

1002-7386(2017)19-2893-05

2017-05-11)