牙齦鱗癌中PTEN基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及預(yù)后分析

李敬東 李峰山 崔競(jìng)飛 代亞欣 趙軍偉 趙中華 梁銳英

·論著·

牙齦鱗癌中PTEN基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及預(yù)后分析

李敬東 李峰山 崔競(jìng)飛 代亞欣 趙軍偉 趙中華 梁銳英

目的探討牙齦鱗癌中PTEN基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其預(yù)后的價(jià)值。方法以唐山市協(xié)和醫(yī)院2005年9月至2010年9月收治的牙齦癌患者石蠟標(biāo)本30例為研究對(duì)象，從中隨機(jī)抽取高、中、低分化各10例(共30例)，用甲基化特異性PCR法檢測(cè)其PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)這些病例PTEN啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀況，結(jié)合牙齦癌患者病歷資料和隨訪信息，采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，分析PTEN甲基化狀態(tài)與牙齦癌預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果30例牙齦鱗癌中PTEN啟動(dòng)子甲基化率為36.7%，且N分期甲基化率高于T分期；PTEN啟動(dòng)子甲基化情況與牙齦鱗癌患者的N分期、細(xì)胞分化程度有顯著相關(guān)性(P<0.05)；PTEN基因啟動(dòng)子甲基化患者的中位生存時(shí)間85個(gè)月，無(wú)甲基化患者的中位生存時(shí)間108個(gè)月，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)TEN啟動(dòng)子甲基化與N分期和細(xì)胞分化程度相關(guān)，可能是影響牙齦鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)評(píng)價(jià)患者預(yù)后具有重要臨床實(shí)際意義。PTEN啟動(dòng)子甲基化在口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起著重要作用，可作為判斷預(yù)后的參考指標(biāo)之一。

牙齦鱗癌；PTEN基因啟動(dòng)子；甲基化；預(yù)后

牙齦癌是常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤之一，以鱗癌最為常見(jiàn)。其中，牙齦鱗癌以無(wú)角化性的鱗癌惡性程度最高。目前，牙齦鱗癌的治療主要以手術(shù)治療為主，由于部位的特殊性，手術(shù)治療會(huì)造成不同程度的顏面部不對(duì)稱等畸形，嚴(yán)重影響美觀，甚至?xí)?duì)患者心理產(chǎn)生巨大的影響。因此研究牙齦癌的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)行有針對(duì)性的靶向治療是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。研究認(rèn)為，牙齦癌與抑癌基因失活相關(guān)[1]。PTEN基因自1997年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，備受廣大研究者的青睞。PTEN基因位于第10號(hào)染色體[2,3]，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，前期研究證實(shí)，牙齦中PTEN基因表達(dá)明顯降低[4]。關(guān)于抑癌基因的作用機(jī)制，目前認(rèn)為主要與基因的表觀遺傳有關(guān)，其中抑癌基因的甲基化在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用，且與預(yù)后密切相關(guān)。關(guān)于PTEN基因甲基化情況與口腔鱗癌的相關(guān)性國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，然而關(guān)于牙齦癌組織中PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)尚未見(jiàn)報(bào)道[5,6]。因此，PTEN基因其是否能作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，仍需進(jìn)一步研究。本文通過(guò)檢測(cè)牙齦鱗癌石蠟組織PTEN啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其觀察隨訪牙齦鱗癌患者PTEN啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，分析PTEN啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與牙齦鱗癌預(yù)后的相關(guān)性，為牙齦鱗癌的預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以唐山市協(xié)和醫(yī)院2005年9月至2010年9月收治的牙齦癌患者石蠟標(biāo)本為研究對(duì)象。納入研究對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)唐山市協(xié)和醫(yī)院病理科診斷為牙齦癌；(2)患者于唐山市協(xié)和醫(yī)院口腔頜面外科行牙齦癌原發(fā)灶切除術(shù)，且同期行頸淋巴結(jié)清掃術(shù)；術(shù)后聯(lián)合放療;(3)診斷患有牙齦癌并進(jìn)行手術(shù)治療的患者的記錄和隨訪時(shí)間超過(guò)60個(gè)月，隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)先前治療過(guò)的牙齦癌患者;(2)頭頸部照射病史;(3)癌癥主要涉及口腔頰、舌頭和上頜竇及其次入侵牙齦的患者;(4)初次診斷時(shí)由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移未接受手術(shù)治療的患者。從中隨機(jī)抽取高、中、低分化各10例(共30例)。從以上30個(gè)病例中抽取10例癌旁正常牙齦組織做為對(duì)照。

1.2 主要試劑與儀器 甲基化處理試劑盒(美國(guó)ZYMO公司)；人陽(yáng)性和陰性標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)ZYMO公司)；DNA純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；Taq酶、PCR相關(guān)試劑(日本Takara公司)；T載體連接試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。NAS-99分光光度計(jì)(ACTGene公司)；BC-subMIDI電泳儀(北京百晶公司)，JY300C電泳槽(北京公司)；1～14離心機(jī)(Sigma公司)；Verity PCR儀(ABI公司)；HW·SY11-K臺(tái)式恒溫金屬浴(TomosBiotools公司)；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)(蘇州凈化工程技術(shù)有限公司)。

1.3 PTEN基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè) 采用MSP法進(jìn)行PTEN基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)，以ZYMO購(gòu)買(mǎi)的陰性和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)進(jìn)行，PTEN基因甲基化引物：F:5’GTTTGTTTTTAGGGTAGTAGGC，R:5’CTTACTCTTACCTAATACAAACAAC，擴(kuò)增片段為248 bp；PTEN非甲基化引物：F:5’TGTTTGTTTTTAGGGTAGTAGGT，R:5’CTTACTCTTACCTAATACAAACAAC，擴(kuò)增片段為248 bp。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，72℃終延伸30 min。

1.4 病歷資料整理 對(duì)患者醫(yī)療記錄及隨訪信息進(jìn)行整理，30例患者的詳細(xì)臨床病理資料結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 牙齦癌患者臨床病理相關(guān)資料

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，具體方法為：將生存時(shí)間由小到大排列；列出每時(shí)刻的死亡數(shù)；生存率估計(jì)采用概率乘法原理，時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)生存曲線間進(jìn)行比較。各指標(biāo)之間相關(guān)因素的差異性比較。采用Fisher確切概率法，Spearman進(jìn)行相關(guān)分析，COX單、多因素回歸模型對(duì)30例術(shù)后患者的多個(gè)臨床病理變量進(jìn)行單、多因素統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲基化結(jié)果 下圖為各組甲基化情況，其中對(duì)照組為正常牙齦組織，M甲基化產(chǎn)物(248 bp)，U非甲基化產(chǎn)物(248 bp)Positive S 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，Negative S陰性標(biāo)準(zhǔn)品，NTC陰性對(duì)照。見(jiàn)圖1。

2.2 不同臨床病理特征牙齦癌PTEN甲基化情況 牙齦鱗癌患者30例，出現(xiàn)PTEN啟動(dòng)子甲基化(56.67%)17例。牙齦癌男性甲基化率46.67%，女性甲基化率66.67%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；牙齦癌60～70歲年齡組甲基化率56.25%，大于70歲年齡組甲基化率57.14%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞高分化組甲基化率20.00%，中分化組甲基化率50.00%，低分化組甲基化率100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T1期組甲基化率55.55%，T2期組甲基化率53.85%，T3期組甲基化率62.50%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)PTEN基因啟動(dòng)子甲基化12例，甲基化率85.7%，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者出現(xiàn)PTEN基因啟動(dòng)子甲基化5例，甲基化率為31.3%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PTEN甲基化率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的PTEN甲基化率，并且牙齦癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PTEN甲基化呈正相關(guān)(r=0.548,P=0.002)。牙齦癌患者PTEN啟動(dòng)子甲基化情況與性別、年齡、T分期等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)；與淋巴轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化程度有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 對(duì)照組和牙齦癌組織中PTEN基因甲基化電泳圖

表2 不同臨床病理特征牙齦癌PTEN甲基化情況 例(%)

2.3 患者臨床病理特征與DFS及OS的單因素分析 生存分析結(jié)果顯示，牙齦癌患者DFS和OS與性別、年齡、T分期無(wú)明顯相關(guān)。牙齦癌患者淋巴轉(zhuǎn)移與無(wú)瘤生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)，與總生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)；PTEN基因啟動(dòng)子甲基化與無(wú)瘤生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)，PTEN基因啟動(dòng)子甲基化與總生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)。隨訪30例牙齦鱗癌患者中，1年、3年、5年生存率分別為97%、86%、63%。PTEN基因啟動(dòng)子甲基化患者的中位無(wú)瘤生存時(shí)間(DFS)與中位總生存時(shí)間(OS)分別為48和56個(gè)月，無(wú)甲基化患者的中位DFS和中位OS分別為83和100個(gè)月，PTEN基因啟動(dòng)子甲基化情況與DFS和OS存在相關(guān)性(P=0.002，P=0.006)，PTEN甲基化牙齦癌患者，預(yù)后較差，無(wú)瘤生存期與總生存期較短；細(xì)胞分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移和PTEN基因啟動(dòng)子甲基化是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3，圖2。

表3 患者臨床病理特征與DFS及OS的單因素分析 n=30

圖2 有無(wú)甲基化牙齦鱗癌患者的總體生存曲線

2.4 相關(guān)影響因素的多因素分析 以牙齦癌患者的預(yù)后為因變量，以細(xì)胞分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、PTEN基因甲基化等因素為自變量，建立多因素回歸模型，進(jìn)行多因素回歸分析。發(fā)現(xiàn)患者的無(wú)瘤生存時(shí)間與患者細(xì)胞分化程度、PTEN啟動(dòng)子甲基化有關(guān)；總生存時(shí)間與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，淋巴轉(zhuǎn)移患者預(yù)后較差，總生存期相對(duì)較短，而與PTEN基因甲基化、細(xì)胞分化程度無(wú)明顯關(guān)。見(jiàn)表4。

表4 牙齦鱗癌患者預(yù)后相關(guān)因素多因素回歸分析

3 討論

牙齦鱗癌為常見(jiàn)的病理類型，早期即可發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，晚期可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此往往預(yù)后不佳，影響生命健康。臨床上，牙齦鱗癌常發(fā)生于口腔皮膚或黏膜鱗狀上皮，其增殖侵入結(jié)締組織形成多個(gè)相連的癌巢，癌巢內(nèi)形成癌珠。其中，牙齦鱗癌以無(wú)角化性的鱗癌惡性程度最高。目前，牙齦鱗癌的主要治療方法為手術(shù)治療，術(shù)后化療可有效防治腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[7,8]。因此，研究牙齦癌發(fā)病的機(jī)制，對(duì)其有效的治療具有重要的作用。

目前認(rèn)為，表觀遺傳因素尤其是抑癌基因的甲基化在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，且與預(yù)后密切相關(guān)。比如基因DAPK、DCC和MINT31的高甲基化特征與口腔癌的組織學(xué)和生物學(xué)特征相關(guān)；口腔癌9個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化的評(píng)估顯示，其臨床病理學(xué)與至少6個(gè)基因的甲基化的“狀態(tài)”之間有緊密聯(lián)系。通過(guò)采用甲基化敏感高分辨率融合的方法，Portela等[9]分析100例喉鱗狀細(xì)胞癌患者CDKN2A/p16、MGMT、MLH1和DAPK基因啟動(dòng)子甲基化的狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子高甲基化患者的患病率分別為60.8%、47.4%、46.4%和42.3%。一些研究已證實(shí)CDKN2A對(duì)原發(fā)腫瘤和口腔鱗癌細(xì)胞系的作用[10]。來(lái)自細(xì)胞系的數(shù)據(jù)顯示，17%～43%的口腔癌細(xì)胞系具有CDKN2A啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化。此外，23%～67%的原發(fā)性腫瘤已經(jīng)檢測(cè)到CDKN2A甲基化，并且該基因的甲基化作為一種重要的標(biāo)記物用于腫瘤篩選和檢測(cè)。CDH1啟動(dòng)子甲基化發(fā)現(xiàn)在多達(dá)85%的口腔腫瘤中18例未表達(dá)CDH1的原發(fā)性口腔癌樣本中有17例甲基化了CDH1[11]。25%～52%的原發(fā)性口腔鱗狀細(xì)胞癌出現(xiàn)MGMT基因甲基化原發(fā)性腫瘤7%～68%的病例[12]發(fā)生DAPK1的甲基化[13]。針對(duì)口腔原發(fā)性癌癥組織中的啟動(dòng)子甲基化已經(jīng)研究了許多基因。一項(xiàng)研究表明，32項(xiàng)原發(fā)性口腔惡性疾病樣本中，15項(xiàng)中檢測(cè)到RARB的甲基化，另外一項(xiàng)研究中25例發(fā)現(xiàn)RARB甲基化15例；另有研究發(fā)現(xiàn)18個(gè)頭頸癌細(xì)胞株中有10個(gè)顯示RARB甲基化，用維甲酸和地西他濱治療頭頸部細(xì)胞系導(dǎo)致RARB的再次表達(dá),對(duì)惡化前病變的大量研究也顯示，124例病變中甲基化RARB 66例(53%)，再次表明甲基化是癌變的重要指標(biāo)[14]。

PTEN是一種抑癌基因，位于人第10號(hào)染色體，全長(zhǎng)為200 kb，由8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子構(gòu)成，與多種癌癥相關(guān)[15,16]，其中包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、牙齦鱗癌等。目前很多研究采用聚合酶鏈技術(shù)[12]和克隆及基因測(cè)序方法分析黏液表皮樣癌、腮腺多形性腺瘤以及正常組織中PTEN基因第5、6、8外顯子是否出現(xiàn)突變或缺失[17,18]，通過(guò)對(duì)其3個(gè)外顯子進(jìn)行克隆及基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)第8外顯子出現(xiàn)突變[19,20]，引起編碼的氨基酸變化[21，22]，遺傳分析表明，5%～10%頭頸部腫瘤癌中存在PTEN基因的異常。免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OSCC區(qū)域的PTEN蛋白表達(dá)較癌旁組織顯著降低(P=0.0104)，同時(shí)，RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OSCC細(xì)胞系PTEN mRNA表達(dá)顯著降低[5,6]。上述結(jié)果表明，PTEN表達(dá)下調(diào)可能與牙齦癌相關(guān)，其在牙齦癌中擔(dān)任什么樣的角色尚不清楚。作為抑癌基因，PTEN備受廣大專家學(xué)者青睞，但其啟動(dòng)子區(qū)甲基化與牙齦鱗癌的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。

在正常牙齦組織中幾乎沒(méi)有PERN基因啟動(dòng)子甲基化的數(shù)據(jù)，但是在癌癥檢測(cè)方案中測(cè)量這種變化已經(jīng)顯示出明顯的變化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)甲基化PCR分析牙齦癌患者PTEN甲基化率，發(fā)現(xiàn)牙齦癌患者甲基化率較高，達(dá)57.67%，與正常牙齦組織存在顯著差異；與高分化牙齦癌相比，低分化牙齦癌組甲基化頻率及甲基化程度均顯著高于高分化組，認(rèn)為PTEN甲基化與牙齦癌密切相關(guān)。PTEN發(fā)生甲基化，腫瘤細(xì)胞增殖就越活躍，代謝程度也會(huì)越高，細(xì)胞分化程度越低。研究還發(fā)現(xiàn)牙齦癌患者PTEN啟動(dòng)子甲基化情況與性別、年齡、T分期等因素?zé)o關(guān)。

本文選取30例牙齦癌患者作為研究對(duì)象，采用MSP法檢測(cè)其PTEN啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)14例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者甲基化率為85.7%，16例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者甲基化率為31.3%。相關(guān)分析顯示PTEN啟動(dòng)子高甲基化率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。一些研究顯示，特定基因的甲基化特征與HNSCC患者的臨床診斷存在顯著相關(guān)性。 例如，DAPK的異常甲基化與診斷為晚期階段和陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),DCC在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的高甲基化與骨侵襲和總體生存率較差相關(guān)，而MINT31的高甲基化被作為預(yù)后差的預(yù)測(cè)因子[23]。甘丙肽和甘丙肽受體2(GALR2)基因的高甲基化與HNSCC患者的無(wú)病生存率具有明顯的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)單因素生存分析顯示PTEN基因啟動(dòng)子甲基化患者的中位無(wú)瘤生存時(shí)間(DFS)與總生存時(shí)間(OS)分別為48和56個(gè)月，無(wú)甲基化患者的DFS和OS分別為83和100個(gè)月，PTEN基因啟動(dòng)子甲基化情況與DFS和OS存在相關(guān)性(P=0.022，P=0.020)，牙齦癌患者PTEN甲基化越高，術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間及總生存時(shí)間越短。本研究出現(xiàn)多種常見(jiàn)預(yù)后因素，如細(xì)胞分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、PTEN甲基化等在單因素分析中，對(duì)DFS和OS均有顯著意義。但在多因素分析中只有細(xì)胞分化程度和PTEN甲基化對(duì)DFS有意義；淋巴轉(zhuǎn)移對(duì)OS有意義，PTEN甲基化對(duì)OS影響未見(jiàn)有顯著性差異。研究結(jié)果顯示PTEN甲基化對(duì)牙齦癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存率的預(yù)測(cè)價(jià)值，這將為牙齦癌患者提供一個(gè)新的檢測(cè)指標(biāo)，有助于提供更積極的治療方式，從而提高患者的生存時(shí)間。

綜上所述，牙齦癌患者中的PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率較牙齦正常組織明顯升高，PTEN基因啟動(dòng)子甲基化與牙齦癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，且影響其預(yù)后。

但由于本次研究樣本量相對(duì)較小，所得結(jié)果有可能不能完全反應(yīng)總體情況，以后的研究中需擴(kuò)大樣本量，對(duì)PTEN基因啟動(dòng)子甲基化與牙齦癌的關(guān)系做進(jìn)一步探討。

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MethylationstatusofPTENgenepromoteringingivalsquamouscellcarcinomaanditsprognosticvalue

LIJingdong*,LIFengshan,CUIJingfei*,etal.

*DepartmentofOralSurgery,XieheHospitalofTangshanCity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo investigate the prognosis of methylation status of PTEN gene promoter in gingival squamous cell carcinoma and its prognostic value.MethodsThirty paraffine-embeded specimens from 30 patients with gingival squamous cell carcinoma who were admitted and treated in Xiehe Hospital of Tangshan City were enrolled in the study. The 30 specimens were randomly divided into three groups: high differentiation group (n=10),moderate differentiation group (n=10) and low differentiation group (n=10).The methylation status of PTEN gene promoter was detected by methylation specific PCR method for the three groups.Then to use Kaplan-Meier method combining with patient’s case history and follow-up data to draw survival curve,and to analyze the correlation between methylation status of PTEN gene promoter and patient’s prognosis.ResultsThe methylation rate of PTEN promoter in 30 cases of gingival squamous cell carcinomas was 36.7%,moreover, the methylation rate at stage N was higher than that at stage T.The PTEN promoter methylation status was closely correlated to stage N of gingival squamous cell carcinoma and cell differentiation degree (P<0.05).The median survival time in patients with PTEN gene promoter methylation was 85 months,however,which in patients without methylation was 108 months,there was a significant difference between them.ConclusionThe PTEN promoter methylation is closely correlated to stage N of gingival squamous cell carcinoma and cell differentiation degree,which may be an independent risk factor influencing patient’s prognosis and may have important clinical significance in evaluating prognosis of patients.PTEN promoter methylation may play an important role in pathogenesis, development and prognosis of oral squamous cell carcinoma,therefor,which can be regarded as one of indexes to evaluate patient’s prognosis.

gingival squamous cell carcinoma;PTEN gene promoter；methylation；prognosis

063000 河北省唐山市協(xié)和醫(yī)院口腔外科(李敬東、崔競(jìng)飛、代亞欣、趙軍偉)；河北省文安縣醫(yī)院口腔科(李峰山)；華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院(趙中華、梁銳英)

梁銳英,063000 河北省唐山市,華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院;

E-mail:lry110@126.com

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.19.004

R 730.23

A

1002-7386(2017)19-2898-05

2017-05-28)