色釘菇多糖抗運動病作用的研究

張濤 劉亞寧 喬蘭俠 姚輝 王立安 王艷芹 管振龍

·論著·

色釘菇多糖抗運動病作用的研究

張濤 劉亞寧 喬蘭俠 姚輝 王立安 王艷芹 管振龍

目的研究色釘菇多糖的抗運動病作用及其最佳劑量。方法以成年雄性SD大鼠為對象，隨機分為空白對照組、實驗對照組和3個不同劑量的色釘菇多糖的實驗組(100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg)，每組12只；實驗對照組和實驗組在胃內給予生理鹽水和相應劑量的色釘菇多糖0.5 h后，用偏離垂直軸旋轉1.5 h復制運動病模型，通過行為學和生物化學方法檢測運動病程度和血清中5-羥色胺(5-HT)和胃動素的水平。結果實驗對照組糖精水攝入量與轉前1 d相比，轉后第1天和第2天相對轉前1 d顯著減少(P<0.01)，轉后第3天攝入量雖然有所增加，但與轉前1 d比較差異仍有統計學意義(P<0.05)；100 mg/kg多糖組糖精水攝入量只在旋轉后第1天相對轉前減少(P<0.05)，第2天就恢復到旋轉前水平(P>0.05)。200 mg/kg多糖組旋轉前后差異無統計學意義(P>0.05)，與空白對照組相似；400 mg/kg多糖組旋轉后第1天，糖精水攝入量較轉前1 d顯著減少(P<0.01)，旋轉后第2天開始提高(P<0.05)，第3天恢復到旋轉前水平。實驗對照組大鼠自主活動明顯減弱，探究活動少，主要表現為靜臥，與空白對照組相比潛伏期顯著增長(P<0.05)。胃內給予色釘菇多糖溶液后旋轉，100 mg/kg、200 mg/kg多糖組大鼠的自主活動能力基本正常，活動頻繁，意識較清楚，探究行為多，潛伏期與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。400 mg/kg多糖組大鼠旋轉后在中央格內停留時間較長，與空白對照組潛伏期比較差異有統計學意義(P<0.01)。實驗對照組修飾時間與空白對照組大鼠相比顯著增加(P<0.05)；胃內給予色釘菇多糖溶液后旋轉，100、200 mg/kg多糖組大鼠在曠場中自主活動相對頻繁，修飾時間與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，與實驗對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。但400 mg/kg多糖組大鼠置于中央格后，意識不清醒，活動能力較弱，在恢復約5 min后修飾行為出現并且修飾時間明顯增加，與空白對照組差異有統計學意義(P<0.05)。偏離垂直軸旋轉刺激后，實驗對照組血清中 5-HT 水平顯著升高(P<0.05)；色釘菇多糖組與實驗對照組相比，5-HT含量降低，且劑量為200 mg/kg 時降低效果最顯著(P<0.05)。而血清中胃動素水平在實驗對照組顯著降低(P<0.05)；色釘菇多糖組則顯著升高(P<0.05)，且劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 時升高的最顯著(P<0.01)。結論色釘菇多糖有顯著的抗運動病作用，以200 mg/kg劑量的效果最佳。

運動病；色釘菇多糖；曠場實驗；5-羥色胺；大鼠

【Abstrat】ObjectiveTo investigate the effects of chroogomphisrutilus polysaccharides on motion sickness and optimal dose in rats.MethodsThirty-six adult male SD rats were randomly divided into blank control group,experimental control group and three experimental groups (chroogomphisrutilus polysaccharides 100mg/kg, 200mg/kg,400mg/kg),with 12 rats in ech group. The rats in experimental control group and three experimental groups were given physiological saline and the corresponding dose of chroogomphisrutilus polysaccharides by gavage,half an hour later, motion sickness models were established by off-vertical axis rotation for 1.5 hours,then the behavioral symptoms of motion sickness and the serum level of the 5-HT,motilin were observed by behavioral approach and biochemical methods,respectively.ResultsAfter medication the autonomic activities and exploratory behavior in experimental control group were obviously decreased, however, the incubation period was significantly increased, as compared with those in blank control group (P<0.05). After medication with chroogomphisrutilus polysaccharides, the autonomic activity abilities in 100mg/kg polysaccharose group and 200mg/kg polysaccharose group were basically normal,and there was no significant difference in incubation period between the two medication groups and blank control group (P>0.05). However the residence time in certral lattice in 400mg/kg polysaccharose group was significantly longer than that in blank control group (P<0.05).The modification time in experimental control group was significantly increased，as compared with that in blank control group ( P < 0． 05) ． After medication the autonomic activities in open field in 100mg /kg polysaccharose group and 200mg /kg polysaccharose group were relatively frequent，but there was no significant difference in modification time between the two medication groups and blank control group ( P > 0 ． 05 ) ，however，there wassignificant difference in modification time between the two medication groups and experimental control group ( P < 0． 05) ． After off-vertical axis rotatory stimulation，the serum levels of 5-HT in experimental control group were significantly increased ( P < 0． 05) ，moreover，the serum levels of 5-HT in polysaccharide groups were significantly decreased，as compared with those in experimental control group，furthermore，the decrease effects in 200mg /kg polysaccharose group were the most obvious ( P < 0． 05) ． The serum levels of motilin in experimental control group were significantly decreased ( P < 0． 05) ，however， which in polysaccharose groups were obviously increased ( P < 0． 05 ) ，moreover the increase degree in 200mg /kg polysaccharose group and 400mg /kg polysaccharose group was most significant ( P < 0． 01) ． As mentioned above，the behavior symptoms of rats with motion sickness were obviously improved after medication with chroogomphisrutilus polysaccharides，and the serum levels of 5-HT were significantly decreased，however the serum levels of motilin were significantly increased by pretreatment with the chroogomphisrutilus polysaccharides． Among the 3 experimental groups，the 200 mg /kg polysaccharide group had the optimal effects of anti - motion sickness． Conclusion The chroogomphisrutilus polysaccharides has obvious anti - motion sickness effects，and the optimal dose is 200mg /kg．

運動病(motion sickness，MS)是暈車、暈船、暈機以及航天運動病的統稱，主要是異常運動或視覺刺激導致的植物神經系統功能紊亂，產生眩暈、嗜睡、惡心、嘔吐等一系列不適癥狀[1]。隨著科技的進步，人類乘坐快速交通工具的時間也越來越長，MS發生的幾率也隨之增加。對于一般人員來說，該癥狀不會導致嚴重的后果，但對于航天員、飛行員或戰士來說則可能是致命的，因為注意力的不集中會導致對儀器操作的失誤或戰斗力的下降，所以研制有效且無副作用的預防和治療MS的藥物是當前的研究熱點之一。當今，關于MS發生的機制，現已提出多種假說，主要有感覺沖突理論、中樞神經遞質失平衡理論、大腦皮質等高級中樞失調假說、內分泌功能異常假說等。盡管上述假說尚不能全面闡述MS發生的機制，但抗MS藥物研制多是從這些假說出發，檢測相應指標的改變情況，如檢測血液內的激素[2-4]——精氨酸加壓素、皮質醇、胃動素等和神經遞質水平[5-7][5-羥色胺(5-HT)、乙酰膽堿、P物質等]、觀察動物行為變化[8](如條件性味覺厭惡、異食癖)等，以確定藥效。廣泛應用的防治MS藥物主要是抗膽堿藥、抗組胺藥、擬交感藥、鈣拮抗劑和胃動劑[9]。這些藥物均能減輕MS癥狀，但都有不同程度的副作用，如嗜睡、注意力下降、視覺模糊等，不能滿足航天員、飛行員和戰士抗MS的需要。近年來發現以中草藥為基礎研制的抗MS藥具有很好的療效，且副作用小，但存在著成分復雜、作用機制不明等缺點，尚不能廣泛應用。因此，研制高效、無毒副作用、成分清楚、作用機制明確的新型抗MS藥物成為本領域最為關注的課題。色釘菇(Chroogomphis Rutilus)，又稱血紅鉚釘菇，屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目鉚釘菇科，俗稱松樹傘、松蘑、紅蘑、肉蘑等。中醫認為，該真菌性平、味甘，具有強身健體，益腸胃，止痛，理氣化痰之功效[10]。研究表明，色釘菇子實體中含有大量的生物活性成分，如三萜類、酚類、黃酮類、苯并吡喃和多糖等，具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫等多種作用[11]。有資料顯示，部分真菌提取物有抗MS效果，如天麻多糖和蜜環菌多糖混合物能有效防治機械旋轉導致的抗暈作用[12]。日本的空間站應用可行性研究文獻中報道，以松蘑為主的蘑菇清湯有明顯的抗MS效果[13]，故推測溶于清湯中的多糖可能是抗MS的有效成分。因此，本文擬以偏離垂直軸旋轉復制運動病模型，通過行為學和生化等檢測方法探討色釘菇多糖對大鼠MS的防治效果，以期為研制新型抗運動病藥物提供新的選項。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠60只，雄性，體重200～250 g，購于河北醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，合格證號：1304014。

1.2 色釘菇多糖與試劑 色釘菇多糖(自制)；食用糖精(天津市北方食品有限公司)；氯化鈉(天津市永大化學試劑有限公司)；戊巴比妥鈉；大鼠胃動素 ELISA 試劑盒(上海滬峰生物科技有限公司)；大鼠 5-HT ELISA試劑盒(上海滬峰生物科技有限公司)。

1.3 儀器 偏離垂直軸旋轉儀(off-vertical axis rotation，OVAR；香港大學醫學院陳應城教授惠贈)；超純水系統(MILLIPOREQB，美國)；冷凍離心機(Centrifuge 5810 R,eppendorf)；磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)；三星ST 600攝像機；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；曠場實驗箱100 cm×100 cm×40 cm(長×寬×高)，箱底均分為 25 個方格(20 cm×20 cm)。

1.4 實驗方法

1.4.1 色釘菇多糖的提取:以蒸餾水洗滌色釘菇子實體3次，洗凈后放入烘箱，45℃烘干備用。將洗凈烘干的子實體粉碎、稱重。以子實體粉末∶蒸餾水=1 g∶10 ml 的比例混合，于80℃水浴鍋內進行水浴加熱，并用電動攪拌棒不間斷攪拌。浸提8 h后，離心(8 000 r/min，10 min)取上清浸提液，回收底部的子實體沉淀，重復加水、水浴、離心、取上清浸提液2次，將3次所得的上清液合并，于旋轉蒸發儀中蒸發濃縮。向濃縮后的浸提液中加入3倍體積的95%乙醇，4℃沉淀過夜，可觀察到色釘菇多糖絮狀物析出。取出絮狀物，用無水乙醇洗滌數次，真空冷凍干燥后即得色釘菇多糖。

1.4.2 ①動物分組及處理:購入大鼠后，隨機分為空白對照組、實驗對照組和3個實驗組(100 mg/kg色釘菇多糖組、200 mg/kg色釘菇多糖組和400 mg/kg色釘菇多糖組)，每組12只，其中6只用于行為學檢測，另6只用于血清內的激素和神經遞質的檢測。進行行為檢測的動物，購入后適應性飼養3 d，在給予OVAR刺激前1 d禁水24 h并適應曠場環境15 min。第2天早晨稱量大鼠體重，在8∶00讓大鼠自由飲用濃度為 0.15%的糖精水45 min，記錄每只大鼠的飲用量。然后，空白對照組和實驗對照組大鼠按10 ml/kg劑量，胃內給予0.9%氯化鈉溶液；3個實驗組大鼠分別按照100 mg/kg、200 mg/kg和400 mg/kg劑量，胃內給予色釘菇多糖溶液。灌胃后30 min，實驗對照組和實驗組動物進行OVAR旋轉刺激誘發運動病，具體參數為偏離垂直軸10°、旋轉頻率1.5 Hz、持續旋轉時間1.5 h。空白對照組不給予旋轉刺激，但置于旋轉刺激儀旁接受噪音刺激。旋轉結束后，各組大鼠均即刻進行曠場實驗檢測，并在第2天8∶00自由飲用0.15% 糖精水45 min，記錄5組糖精水的飲用量，連續記錄3 d。②檢測血清內的激素和神經遞質的動物除不進行糖精水厭惡和曠場實驗外，其他處理同上。

1.4.3 曠場實驗:將大鼠放入曠場中央格內，用錄像機記錄大鼠10 min在曠場內的活動情況。每次實驗結束后用消毒酒精擦拭箱底和四壁，以去除上只大鼠尿液、糞便的影響。統計大鼠潛伏期(曠場底面中央的9個格為中央區域，在中央區域的停留時間)、修飾行為(舔毛、舔足、兩前肢理毛、撫嘴等)。

1.5 檢測血漿中神經遞質和激素含量 旋轉刺激結束后的 30 min 內采血。采血時，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，麻醉后打開腹腔，剪開心包，用 5 ml 注射器心尖部采血 4～5 ml。將所采的血液在室溫靜置60 min后，置于冷凍離心機中，4℃、 3 000 r/min離心 15 min，取上清液即血清分裝于 EP 管中待測。具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 動物行為表現 空白對照組大鼠未經灌胃和旋轉，雖然在實驗對照組旋轉時被放置于儀器旁，但活動均正常。表現為意識清楚，活動靈敏，四肢行走正常，探索行為較多，進食、飲水正常未受影響；實驗對照組大鼠在OVAR旋轉刺激結束后，表現為運動少、活動范圍小、走路打晃、行為遲緩、目光呆滯、呼吸急促、顫抖、炸毛和大小便失禁等明顯的運動病癥狀；實驗組中，100 mg/kg組合400 mg/kg組大鼠表現為活動少、較多的修飾行為、少量的尿失禁、輕微的顫抖和豎毛，而200 mg/kg組大鼠基本與空白對照組的活動相似，走路迅捷、步態穩定、無大小便失禁、豎毛、顫抖等行為，僅有少量的修飾行為。

2.2 糖精水條件性味覺厭惡檢測結果 空白對照組大鼠在前后4 d的精水攝入量差異無統計學意義(P>0.05)；實驗對照組糖精水攝入量與轉前1 d相比，轉后第1天和第2天相對轉前1 d顯著減少(P<0.01)，轉后第3天攝入量雖然有所增加，但與轉前1 d比較差異仍有統計學意義(P<0.05)；100 mg/kg多糖組糖精水攝入量只在旋轉后第1天相對轉前減少(P<0.05)，第2天就恢復到旋轉前水平(P>0.05)。200 mg/kg多糖組旋轉前后差異無統計學意義(P>0.05)，與空白對照組相似；400 mg/kg多糖組旋轉后第1天，糖精水攝入量較轉前1 d顯著減少(P<0.01)，旋轉后第2天開始提高(P<0.05)，第3天恢復到旋轉前水平。見表1。

組別轉前1d轉后第1天轉后第2天轉后第3天空白對照組 10．92±2．999．60±2．6011．58±1．8412．00±1．74實驗對照組 12．58±1．916．02±2．44#8．20±2．35#9．75±1．75?100mg/kg多糖組15．18±2．4810．98±3．00?12．77±4．0215．15±3．58200mg/kg多糖組14．23±4．0413．75±1．0714．52±2．4316．12±2．85400mg/kg多糖組13．82±2．419．15±2．54#13．28±2．90△14．73±2．58☆

注：與轉前1 d比較,*P<0.05,#P<0.01;與轉后第1天比較,△P<0.05;與轉后第1天比較,☆P<0.01

2.3 曠場實驗結果

2.3.1 潛伏期統計結果：實驗對照組大鼠自主活動明顯減弱，探究活動少，主要表現為靜臥，與空白對照組相比潛伏期顯著增長(P<0.05)。胃內給予色釘菇多糖溶液后旋轉，100 mg/kg、200 mg/kg多糖組大鼠的自主活動能力基本正常，活動頻繁，意識較清楚，探究行為多，潛伏期與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。400 mg/kg多糖組大鼠旋轉后在中央格內停留時間較長，與空白對照組潛伏期比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

2.3.2 修飾時間統計結果：空白對照組大鼠，活動正常，舔毛、撫嘴等修飾動作出現少，時間短；實驗對照組，運動病癥狀明顯，自主探究活動極少，恢復約5 min后出現舔毛、舔足、兩前肢撫嘴等修飾行為，修飾時間與空白對照組大鼠相比顯著增加(P<0.05)；胃內給予色釘菇多糖溶液后旋轉，100 mg/kg、200 mg/kg多糖組大鼠在曠場中自主活動相對頻繁，修飾時間與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，與實驗對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。但400 mg/kg多糖組大鼠置于中央格后，意識不清醒，活動能力較弱，在恢復約5 min后修飾行為出現并且修飾時間明顯增加，與空白對照組差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3.3 修飾次數：實驗對照組較空白對照組修飾次數有增加的趨勢，胃內給與色釘菇多糖后旋轉，100 mg/kg、200 mg/kg多糖組大鼠修飾次數有減少的趨勢。但400 mg/kg多糖組大鼠修飾次數與實驗對照組相近。5組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組別 潛伏期(s)修飾時間(s)修飾次數(次)空白對照組 5．50±5．4316．67±5．822．33±1．21實驗對照組 21．50±15．78?99．17±50．05?4．67±3．50100mg/kg多糖組6．17±7．0518．33±24．16△1．17±1．60200mg/kg多糖組4．33±4．13△☆18．83±23．99△1．33±1．21400mg/kg多糖組23．33±11．60#63．50±48．29?4．00±3．90

注：與空白對照組比較,*P<0.05,#P<0.01;與實驗對照組比較,△P<0.05;與400 mg/kg多糖組比較,☆P<0.01

2.4 血清中神經遞質和激素含量的實驗結果 偏離垂直軸旋轉刺激后，實驗對照組血清中 5-HT 水平顯著升高(P<0.05)；色釘菇多糖組與實驗對照組相比，5-HT含量降低，且劑量為200 mg/kg 時降低效果最顯著(P<0.05)。而血清中胃動素水平在實驗對照組顯著降低(P<0.05)；色釘菇多糖組則顯著升高(P<0.05)，且劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 時升高的最顯著(P<0.01)。這提示色釘菇多糖有降低運動病大鼠血清5-HT和升高胃動素水平的作用。見表3。

組別5?HT胃動素空白對照組 117．81±29．95210．25±51．08實驗對照組 170．40±44．03?139．91±34．99?100mg/kg多糖組134．95±23．26204．46±55．89#200mg/kg多糖組121．01±28．86#216．90±38．65△400mg/kg多糖組141．98±26．02220．58±27．32△

注：與空白對照組比較,*P<0.05；與實驗對照組比較,#P<0.05,△P<0.01

3 討論

在以大、小鼠為對象的運動病機制和防治藥物的研究中，復制運動病模型的方法有多種，其中本研究所用的偏離垂直軸旋轉是以刺激耳石器來復制運動病模型的一種方法，是有效的常用手段之一。復制成功的運動病大鼠，在行為上主要表現為活動減少、修飾行為增多、炸毛、顫抖、大小便失禁等，這些行為表現成為檢測運動病程度的重要指標[14]。條件性味覺厭惡是近年來用以檢測運動病程度的另一個較為客觀的行為指標[15]。其原理是，如果在運動病復制前給予糖精水，動物會將內臟或身體的不適與攝取糖精水的行為聯系起來而建立對糖精水的條件性味覺厭惡反射，當再次給予糖精水時，動物對糖精水的攝取量會顯著減少；再次飲用糖精水的量及其恢復正常飲用量所需時間均可作為運動病程度的指標。研究結果顯示，復制運動病前半小時胃內給予色釘菇多糖，能顯著增加動物的活動，無炸毛、顫抖、大小便失禁等運動病癥狀，特別是200 mg/kg劑量組動物，其行為與空白對照差異無統計學意義(P>0.05)；在復制運動病前后4 d的糖精水飲用量上，200 mg/kg劑量組動物與空白對照組相似，4 d之間差異無統計學意義(P>0.05)。曠場實驗的實驗數據統計結果也表明，給予色釘菇多糖后(100 mg/kg和200 mg/kg)大鼠在潛伏期、修飾時間和修飾次數上均與空白差異無統計學意義(P>0.05)。這些行為學檢測結果提示，色釘菇多糖有顯著地減輕運動病癥狀的作用，特別是200 mg/kg劑量的效果最佳。

惡心、嘔吐、胃腸功能紊亂是運動病主要表現，而胃腸功能紊亂與調節其運動的胃腸激素的分泌密切相關，其中5-HT分泌的增加和胃動素分的降低是顯著的特征[16]。有證據表明，運動病發生時血液中顯著增加的5-HT是胃腸道分泌的，因腦干中縫核分泌的5-HT不能通過血腦屏障擴散至血液[17]。但胃腸道分泌的5-HT激活腸壁內的迷走神經傳入末梢，將信號傳至孤束核而引起相應的反射[18]。大量的研究表明，5-HT及其受體與運動病的發生密切相關，且5-HT3受體拮抗劑已作為有希望的抗運動病藥物而備受關注[5,19,20]。血清中胃動素水平也常作為抗運動病藥物的一個指標[4]。本實驗所得結果顯示，運動病大鼠血清中5-HT顯著升高、胃動素水平顯著降低，這與已有資料相同；在預先給予色釘菇多糖后，則血清中5-HT顯著降低、胃動素顯著升高，特別是200 mg/kg組，其與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。這提示色釘菇多糖的抗運動病作用可能與其降低胃腸分泌5-HT和升高胃動素的分泌有關。

本研究通過對行為學與血液神經遞質和激素水平變化的研究，表明色釘菇多糖的確表現出顯著的抗運動病效果，有開發成防治運動病藥物的前景。本研究結果為防治運動病藥物的篩選提供了新的選項和思路。

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Effectsofchroogomphisrutiluspolysaccharidesonmotionsicknessinrats

ZHANGTao*,LIUYaning,QIAOLanxia,etal.

*CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050024,China

motion sickness;chroogomphisrutilus polysaccharides;open field test;5-HT;rats

項目來源：河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究項目(編號：16237301D)；河北師范大學研究生創新資助項目(編號：xj2016033)

050024 石家莊市，河北師范大學生命科學學院(張濤、姚輝、王立安、王艷芹、管振龍)；河北經貿大學經濟管理學院(劉亞寧)；石藥集團中央藥物研究二院(喬蘭俠)

管振龍，050024 石家莊市，河北師范大學生命科學學院；

E-mail:zlguan60@hebtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.19.010

R 852.33

A

1002-7386(2017)19-2922-05

2017-02-08)