維生素BT片溶出度檢測的方法建立

耿韞 郭永輝 王潤彪

·藥物研究·

維生素BT片溶出度檢測的方法建立

耿韞 郭永輝 王潤彪

目的建立維生素BT片溶出度的檢測方法。方法溶出度采用槳法，以0.1 mol/L鹽酸1 000 ml作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r/min；含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)，采用phenomenex Luna C18 (250×4.6 mm，5 m)色譜柱；流動相：磷酸鹽緩沖液[取11.5 ml磷酸加入1 900 ml水中，再加入100 ml氫氧化鈉(1 mol/L)溶液，調(diào)pH值為2.4]-甲醇(95∶5)，每1 000 ml加入555 mg庚烷磺酸鈉；檢測波長：215 nm；流速：1.0 ml/min。結(jié)果維生素BT線性范圍為 10～1 000 μg/ml(r=1.0000)，平均回收率100.56%，溶出曲線表明45 min內(nèi)維生素BT片可溶出85%以上。結(jié)論所建方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于維生素BT片的溶出度測定。

維生素BT片；溶出度；HPLC

維生素BT又叫肉毒堿(Carnitine)，是一種類維生素(分子式C7H15NO3)，肉毒堿是廣泛存在于大自然界中的一種高極性、小分子季胺類化合物,為人體必需營養(yǎng)素,有重要的生化功能和臨床應(yīng)用價值。近年來,肉毒堿在心腦血管疾病、消化道疾病、兒童疾病的預(yù)防、治療以及血液透析患者的營養(yǎng)支持和運動醫(yī)學(xué)及生殖醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,都得到廣泛研究和應(yīng)用。它在哺乳動物中的脂肪代謝和能量產(chǎn)生中也起著特別重要的作用，其中參與脂肪酸的運輸和氧化、脂肪的合成、酮體的利用等，在動物性食物中含量高，在植物性食物中含量低。例如：美國科學(xué)家曾發(fā)現(xiàn)紅肉中的“維生素BT”可能引發(fā)心血管疾病，研究結(jié)果顯示，維生素BT在肝臟中的轉(zhuǎn)化物質(zhì)“氧化三甲胺”與血管脂肪沉積存在密切聯(lián)系，可以促使人體動脈粥樣硬化，從而引發(fā)心血管疾病。如果有些人認(rèn)為維生素BT是一種必需的膳食營養(yǎng)物，那么則會有可能出現(xiàn)人類的膳食中因缺乏維生素BT而引起的缺乏癥。截止到目前為止，維生素BT還沒有達(dá)到這個標(biāo)準(zhǔn)。過量得攝入會產(chǎn)生哪些毒性現(xiàn)在還不清楚。在正常的情況下，不規(guī)定膳食中維生素BT的需要量。然而出現(xiàn)代謝異常，會抑制維生素BT的合成，干擾利用或增加維生素BT的分解代謝，疾病可能降臨。膳食中經(jīng)常會供應(yīng)維生素BT，可以減少疾病的發(fā)生。維生素BT常用于消化功能失調(diào)，包括消化不良，對于胃酸缺乏癥和消化不良和食欲減退和慢性胃炎，以及嬰幼兒厭食與食欲缺乏癥狀有一定的調(diào)試和緩解作用。作為輔助藥物，現(xiàn)在市場上存在有維生素BT片、維生素BT膠囊，以及一些左旋肉堿膠囊，也是將肉毒堿作為藥物的主要成分。目前國內(nèi)有3個生產(chǎn)廠家，規(guī)格均為0.1 g。溶出度是評價口服固體制劑生產(chǎn)工藝和質(zhì)量的重要方法之一，同時也是口服固體制劑體外一致性評價的有效方法，因此溶出度是口服固體制劑質(zhì)量控制的重要檢測項目。維生素BT片現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-(HD-0076)-2002[1]，沒有設(shè)置的溶出度檢查，同時國內(nèi)外也無維生素BT片溶出度測定的相關(guān)文獻(xiàn)報道。因此，建立準(zhǔn)確可靠的維生素BT片溶出度測定方法，可以有效控制維生素BT片的質(zhì)量，保證藥品安全有效。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695的液相色譜儀(美國Waters公司)；SOTAX AT 7藥物溶出儀(瑞士SOTAX公司)；XS105電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 試劑與試藥 選擇純度為98.3%的維生素BT片(市售品，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的批號為：006160301，006160302，006160303這三個批號的試藥；其規(guī)格均為每片0.1 g)；甲醇為色譜純，鹽酸為分析純。

2 溶出度條件的摸索

2.1 溶出方法 參照其他片劑相關(guān)溶出度測定方法，我們采用片劑最為常用的槳法作為溶出方法。

2.2 溶出介質(zhì) 參照國內(nèi)外有關(guān)藥典針對溶出度測定的要求[1]，其轉(zhuǎn)速采用50 r/min，對同一批維生素BT片在0.1 mol/L鹽酸、pH值4.0醋酸鹽緩沖液、pH值6.8磷酸鹽緩沖液、水這四種溶出介質(zhì)中的溶解曲線進(jìn)行了考察。以時間點為橫坐標(biāo)，相應(yīng)時間點的累計溶出量為縱坐標(biāo)，制作溶出曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素BT片在pH值4.0醋酸鹽緩沖液、水、pH值6.8磷酸鹽緩沖液這三種介質(zhì)中溶出較快，30 min溶出均為超過85%。而在0.1 mol/L鹽酸中溶出相對較慢，故選擇0.1 mol/L鹽酸作為溶出介質(zhì)，體積為1 000 ml。見圖1。

圖1 溶出介質(zhì)選擇

2.3 轉(zhuǎn)速 對同一批維生素BT片在0.1 mol/L鹽酸中，轉(zhuǎn)速分別采用50 r/min、75 r/min、100 r/min進(jìn)行溶出曲線考察，以時間為橫坐標(biāo)，每個時間點的累積溶出量為縱坐標(biāo)，制作溶出曲線。累積溶出量與轉(zhuǎn)速呈正相關(guān)性，在75 r/min、100 r/min這2種轉(zhuǎn)速條件下，維生素BT片累積溶出度均大于85%，且片劑溶出度均一性均良好，為更好區(qū)分溶出行為，因此選擇低轉(zhuǎn)速50 r/min作為實驗條件。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)速選擇

2.4 溶出時間及溶出限度 對同一批維生素BT片在0.1 mol/L鹽酸中，轉(zhuǎn)速50 r/min且45 min、60 min兩個時間點的累積溶出量偏差小于5%，因此確定溶出度取樣時間為45 min。同時參照溶出度相關(guān)文獻(xiàn)和技術(shù)要求[1-15]，以45 min 溶出量減15%即為溶出限度。45 min溶出量為90.2%，因此溶出限度最終設(shè)定為75%。

2.5 建立溶出度方法 根據(jù)上述實驗摸索，最終確定維生素BT片的溶出條件：采用槳法，0.1 mol/L鹽酸1 000 ml作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速50 r/min，45 min時取溶液適量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3 含量測定

3.1 色譜條件 參照維生素BT片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-10001-(HD-0076)-2002中含量測定的色譜條件[6]，經(jīng)優(yōu)化后進(jìn)行維生素BT含量測定。采用phenomenex Luna C18 (250×4.6 mm，5 m)色譜柱；流動相：磷酸鹽緩沖液[取11.5 ml磷酸加入1 900 ml水中，再加入100 ml氫氧化鈉(1 mol/L)溶液，調(diào)pH值為2.4]-甲醇(95∶5)，每1 000 ml加入555 mg庚烷磺酸鈉；檢測波長：215 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl。

3.2 對照品溶液 精密稱取維生素BT。

3.3 供試品溶液 取維生素BT片，按“2.5”項下進(jìn)行溶出度實驗，取續(xù)濾液直接測定。

3.4 線性范圍 稱取維生素BT對照品10.00 mg，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成983 μg/ml的溶液。分別精密量取上述溶液適量，加0.1 mol/L鹽酸溶解并稀釋制成濃度為491.5 μg/ml、196.6 μg/ml、98.3 μg/ml、49.15 μg/ml、9.83 μg/ml的對照品溶液，按“3.1”項下進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=33586817.41x-26142.30，r=1.0000，表示在10～1 000 μg/ml的范圍內(nèi)線性良好。

3.5 精密度 取對照品溶液，同一份按“3.1”項下平行測定6次。以峰面積計算精密度結(jié)果。得出RSD為0.03%(n=6)，表明該方法的精密度良好。

3.6 方法回收率 分別精密量取對照品溶液8 mg、10 mg、12 mg分別置100 ml量瓶中，按比例加入相關(guān)輔料，用0.1 mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，按“3.1”項下進(jìn)行測定。回收率結(jié)果得出：該法的平均回收率為100.56%，RSD為0.36%。見表1。

表1 回收率結(jié)果

3.7 輔料、濾膜干擾排除 按處方比例稱取輔料，混勻，用0.1 mol/L鹽酸溶解，取續(xù)濾液按“3.1”項下進(jìn)行測定，結(jié)果表明在維生素BT保留時間處無特征峰出現(xiàn)，表明輔料對測定結(jié)果無影響。同時取“3.3”項下的供試品溶液，分別采用過濾和離心操作，按“3.1”項下進(jìn)行測定，結(jié)果兩種處理方法的結(jié)果基本一致，表明濾膜對測定結(jié)果也不存在顯著干擾。

3.8 穩(wěn)定性試驗 取“3.3”項下的供試品溶液，在室溫下分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)行測定，結(jié)果維生素BT含量的RSD=0.67%(n=6)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.9 溶出度測定 按“2.5”項下溶出度條件對3批維生素BT片進(jìn)行溶出度實驗，采用“3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，建立的維生素BT片溶出度方法可以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。見表2。

表2 3批維生素BT片溶出度結(jié)果 %

4 討論

4.1 體外溶出度是口服固體制劑的重要指標(biāo)，與體內(nèi)生物利用度具有一定相關(guān)性。凡檢查溶出度的制劑，不再進(jìn)行崩解時限的檢查。近年來研究證明，易溶性藥物也會因制劑的配方和工藝不同而致藥物溶出度有很大差異，從而影響藥物生物利用度和療效，在USP中規(guī)定測定溶出度的制劑有相當(dāng)數(shù)量是易溶性藥物[16]。

4.2 固體制劑中的藥物在被吸收前，必須經(jīng)過崩解和溶解然后轉(zhuǎn)為溶液的過程，因此，藥物在體內(nèi)吸收速度通常由溶解的快慢而決定。某些藥理作用劇烈、安全指數(shù)小、吸收迅速的藥物，如果溶出速度太快，會產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，藥效也縮短，故需要對制劑中藥物的溶出速率應(yīng)予以控制。

4.3 影響藥物溶出度的因素包括：(1)儀器的性能及操作水平，如介質(zhì)除氣程度、儀器振動情況、攪拌速度、取樣點位置等。(2)藥物本身因素，如溶解度、藥物表面積、藥物結(jié)構(gòu)和晶型。(3)制劑因素，如劑型、處方組成、藥物的相互作用、藥物粒度等。

4.4 仿制藥一致性評價是指對已經(jīng)批準(zhǔn)上市的仿制藥，按與原研藥品質(zhì)量和療效一致的原則，分期分批進(jìn)行質(zhì)量一致性評價，目的使仿制藥在質(zhì)量和療效上與原研藥一致，在臨床上可替代原研藥，這不僅可以節(jié)約醫(yī)療費用，同時也可提升我國的仿制藥質(zhì)量和制藥行業(yè)的整體發(fā)展水平，保證公眾用藥經(jīng)濟，安全、有效[17,18]。仿制藥一致性評價在我國是補課，也是創(chuàng)新。

4.5 國家食藥監(jiān)總局(CFDA)2012年啟動了仿制藥的質(zhì)量一致性評價工作，涉及20家藥品生產(chǎn)企業(yè)。2013年發(fā)布《仿制藥質(zhì)量一致性評價工作方案》，對75個仿制藥品種與原研藥的質(zhì)量比對工作，并將“提高仿制藥質(zhì)量，加快仿制藥質(zhì)量一致性評價”作為改革藥品審評審批制度的五大目標(biāo)之一。2016年CFDA轉(zhuǎn)發(fā)了國務(wù)院辦公廳發(fā)布的《關(guān)于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見》，意味著一致性評價的大幕事實上已正式拉開。

4.6 仿制藥一致性評價過程中，需要藥品生產(chǎn)企業(yè)的全面參與，深入地開展比對研究，包括處方、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、晶型、粒度和雜質(zhì)等主要藥學(xué)指標(biāo)比較研究，以及固體制劑溶出曲線的比較研究[19]。

4.7 為確保維生素BT片的臨床有效性，保證藥品質(zhì)量穩(wěn)定，對維生素BT片進(jìn)行溶出度測定十分必要。本文建立的維生素BT片溶出度測定方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，操作簡便，可以對維生素BT片產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行有效控制；同時建議的現(xiàn)行維生素BT片藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加溶出度的檢測。

4.8 凡檢查溶出度的制劑，不再進(jìn)行崩解時限的檢查。

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