阿托伐他汀對腦出血大鼠腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β表達的影響*

吳 煜，鄒顯巍，程閏夏

1.成都醫學院 發育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；2.成都醫學院第一附屬醫院 (成都 610500)；3.西南醫科大學(瀘州 646000)

·論著·

阿托伐他汀對腦出血大鼠腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β表達的影響*

吳 煜1，鄒顯巍2△，程閏夏3

1.成都醫學院 發育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；2.成都醫學院第一附屬醫院 (成都 610500)；3.西南醫科大學(瀘州 646000)

目的觀察阿托伐他汀對腦出血大鼠血腫周圍組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β表達的影響，探討阿托伐他汀對腦出血大鼠的腦保護作用及可能的機制。方法將120只SD大鼠按隨機數字表法隨機分為假手術組、腦出血組和治療組。腦出血組和治療組采用自體血立體定向注射法，建立腦出血動物模型。假手術組于相同部位注射等量0.9%氯化鈉注射液。治療組于術后2 h將阿托伐他汀按10 mg/kg進行灌胃。于造模后12 h、1 d、2 d、3 d和5 d分別處死各組大鼠留取腦組織。采用免疫組化法和Western blot法檢測各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β及NF-κB的蛋白表達情況。結果與假手術組相比，腦出血組TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達增加(P<0.05),均為12 h開始持續增加，3 d時達高峰，持續表達至5 d；與腦出血組相比，治療組TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達減少(P<0.05)。結論腦出血大鼠血腫周圍腦組織存在NF-κB、TNF-α和IL-1β的高表達。阿托伐他汀可通過下調NF-κB信號分子的表達及炎性細胞因子的產生，減輕腦出血后腦組織的炎癥反應，從而起到腦保護的作用。

阿托伐他汀；腦出血；NF-κB；TNF-α；IL-1β

腦出血在腦卒中各亞型中發病率僅次于缺血性腦卒中，居第2位。腦出血在亞洲人、高齡、男性和中低收入國家更普遍。腦出血病死率高(1個月為40%，1年為54%)，僅12%～39%的患者能實現長期功能獨立[1-2]。腦出血致殘致死率均較高，但目前缺乏有效的治療措施。臨床和實驗證據表明，腦出血發生后，除血腫壓迫引起的機械性神經組織損害外，還存在血腫周邊繼發性損傷，包括腦組織水腫，炎癥、局部腦血流下降和細胞凋亡等，其中炎癥反應在腦出血繼發性損害中發揮重要作用，日益引起重視。本實驗通過觀察阿托伐他汀對腦出血大鼠血腫周圍組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β表達的影響，明確其對腦出血血腫周圍組織是否有腦保護功能。

1 材料與方法

1.1動物

健康雄性SD大鼠120只，購于成都達碩實驗動物有限公司，體質量250～300 g。

1.2藥物與試劑

阿托伐他汀鈣片購于輝瑞制藥有限公司。兔抗大鼠NF-κB、TNF-α和IL-1β多克隆抗體，通用型二抗試劑盒及Western blot試劑盒購于武漢三鷹生物技術有限公司。GAPDH兔多克隆抗體購于杭州賢至生物科技有限公司。免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3分組與造模

將大鼠按隨機數字表法隨機分成假手術組、腦出血組和治療組，每組40只。治療組于造模后2 h給予10 mg/kg的阿托伐他汀灌胃， 1次/d。假手術組和腦出血組在相同時間給予相同劑量的0.9%的氯化鈉注射液灌胃。制備大鼠腦出血模型。用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠(400 mg/kg)。參考文獻[3-4],將大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，調節門齒托高度，使大鼠前囟、后囟處于同一水平。沿頭皮正中切10～20 mm切口，無菌操作暴露前囟，用30%的雙氧水燒灼前囟。待前囟燒灼清楚后，定位于前囟前0.4 mm，中線向右旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的小孔，進針深度為5.5～6.0 mm(即尾狀核位置)。將大鼠尾部消毒，斷尾后用微量進樣器取自體血50 μL，迅速將微量進樣器通過顱骨鉆孔進針到尾狀核位置。用微量泵按15 μL/min注射自體血，留針10 min以防止血液溢出。第2次抽取50 μL自體血，按同樣方法注入尾狀核。注射后留針10 min，緩慢退出微量進樣器，用醫用石蠟封閉骨孔。觀察無出血后縫合皮膚。對照組操作方法同上，只將微量進樣器注射到目標腦區，不注射自體血，留針10 min。本實驗嚴格按照無菌要求進行，術后將大鼠放回籠中繼續飼養。

1.4腦出血模型成功評價

參考Longga 5級評分法對大鼠神經進行神經功能評分。0級：無體征，記0分。1級：動物不能完全伸直前肢，記1分。2級：動物一側肢體癱瘓，有追尾現象，記2分。3級：動物不能站立或打滾，記3分。4級：無自發性活動，有意識障礙記4分。本實驗共造模成功103只，造模失敗17只(術中不明原因死亡7只，術后死亡10只。)

1.5WesternBlot分析

從-80 ℃冰箱取各組的腦組織，將尾狀核附近組織剪下約100 mg，倒入少許液氮后研磨成粉末，加入蛋白裂解液裂解1 h，13 000r/min，4 ℃離心15 min，取上清分裝，放入-80 ℃冰箱保存備用。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗大鼠的NF-κB、TNF-α和IL-1β(稀釋濃度均為1∶1 000)，兔抗大鼠的GAPDH(稀釋濃度為1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST漂洗3次，10 min/次。然后用羊抗兔的Ig-G(稀釋濃度為1∶4 000)37 ℃孵育2 h。用TBST漂洗3次后，將條帶放在化學發光儀上，按1∶1比例將適量顯影液混勻后滴加在蛋白表達條帶上進行顯影。以Image J軟件對蛋白表達條帶進行灰度掃描和定量分析。以目標蛋白與GAPDH蛋白平均吸光度值(OD值)的比值作為分析對象。

1.6免疫組化

將各組大鼠按不同時間點灌注取腦，用4%多聚甲醛固定2 d，將腦組織取出用PBS漂洗3次，加30%蔗糖脫水沉底，OTC包埋劑包埋后用液氮進行快速冰凍成塊，放入-20 ℃冰箱保存備用。將包埋好的組織按10 μm厚度進行切片。按免疫組化試劑盒說明書進行操作。

1.7統計學方法

2 結果

2.1實驗性腦出血大鼠周圍組織NF-κB的定量表達

在不同時間點，假手術組可見少量NF-κB表達；與假手術組相比，腦出血組可見大量的NF-κB蛋白表達(P<0.05)；各時間點治療組NF-κB蛋白表達量較腦出血組減少，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖1～3、表1)。

圖1WesternBlot檢測不同時間點(12h、1d)腦組織中各炎癥因子蛋白的表達

2.2實驗性腦出血大鼠周圍組織TNF-α的定量表達

在不同時間點，假手術組中的TNF-α蛋白呈弱表達；與假手術組相比，腦出血組的TNF-α蛋白表達增多(P<0.05)；治療組與腦出血組相比，TNF-α蛋白的表達量減少(P<0.05)(圖1～3、表2)。

圖2WesternBlot檢測不同時間點(2d、3d)腦組織中各炎癥因子蛋白的表達

圖3WesternBlot檢測不同時間點(5d)腦組織中各炎癥因子蛋白的表達

2.3實驗性腦出血大鼠周圍組織IL-1β的定量表達

假手術組可見微量的IL-1β表達；與假手術組相比，腦出血組可見大量的IL-1β蛋白表達(P<0.05)；治療組與腦出血組相比，IL-1β蛋白的表達量減少(P<0.05)(圖1～3、表3)。

2.4相關性分析

腦出血后血腫周圍腦組織NF-κB與TNF-α的蛋白表達水平呈正相關(各組r>0，P<0.01);同時與IL-1β的蛋白表達水平也呈正相關(各組r>0，P<0.01)。

表1 腦組織中NF-κB p65蛋白表達的定量分析(OD值

注：與假手術組相比，#P<0.05;與腦出血組相比，*P<0.05

表2 腦組織中TNF-α蛋白表達的定量分析 (OD值

注：與假手術組相比，#P<0.05;與腦出血組相比，*P<0.05

表3 腦組織中IL-1β蛋白表達的定量分析 (OD值

注：與假手術組相比，#P<0.05;與腦出血組相比，*P<0.05

2.5實驗性腦出血大鼠周圍組織IL-1β的定位表達

IL-1β陽性細胞在腦組織中主要表現為細胞膜或細胞漿中出現棕褐色顆粒。假手術組偶見IL-1β陽性細胞。腦出血組可見大量IL-1β陽性細胞，1 d、2 d時陽性細胞明顯增多，3 d達高峰，5 d時明顯減少。與相同時間點的腦出血組相比，治療組中的陽性細胞明顯減少(圖4)。

2.6實驗性腦出血大鼠周圍組織TNF-α的定位表達

TNF-α陽性細胞呈棕褐色，主要分布在細胞漿和細胞膜。假手術組可見微量的TNF-α陽性細胞。腦出血組1 d、2 d時陽性細胞持續增多，3 d達高峰，5 d時明顯減少。與相同時間點的腦出血組相比，治療組中的陽性細胞可見大量減少(圖5)。

2.7實驗性腦出血大鼠周圍組織NF-κB的定位表達

NF-κB陽性細胞呈棕褐色，主要分布在細胞核。假手術組可見極少量的陽性細胞。與假手術組相比，腦出血組NF-κB陽性細胞明顯增多，1 d、2 d時陽性細胞持續增多，3 d達高峰，5 d時明顯減少。與相同時間點的腦出血組相比，治療組的NF-κB陽性細胞明顯減少(圖6)。

圖4 腦組織中IL-1β的表達(免疫組織化學染色，400X)

圖5 腦組織中TNF-α的表達(免疫組織化學染色，400X)

圖6 腦組織中NF-κB p65的表達(免疫組織化學染色，400X)

3 討論

本實驗就創傷性腦損傷后NF-κB與TNF-α(或IL-1β)的表達進行了相關性分析，結果顯示，NF-κB與TNF-α(或IL-1β)均呈正相關性，揭示NF-κB 可能正向調控TNF-α和IL-1β蛋白的表達，從而引發炎癥反應。這可能與腦出血繼發性損害中出現炎癥反應有關。NF-κB在炎癥相關疾病的發病機制中起到關鍵作用[5]。多種炎癥介質基因的啟動子和增強子中存在一個或多個κB序列，如IL-8 、IL-6 、TNF-a和VCAM-1等。NF-κB是炎癥反應中的關鍵性核轉錄因子,活化的NF-κB可單獨或與其他轉錄因子協同參與上述介質基因的誘導表達[6-8]。NF-κB猶如炎癥介質基因轉錄的啟動開關，可誘導多種細胞因子和黏附分子等的表達，從而激發炎癥瀑布反應，造成組織損傷。NF-κB可刺激TNF-α和IL-1β等細胞因子的表達，同時這些細胞因子又是NF-κB的刺激劑，可進一步活化NF-κB，只有激活的NF-κB才能被轉運到細胞核，從而造成持續或放大的炎癥反應[9]。動物實驗研究[10-12]發現，他汀類藥物可能從以下幾個方面起作用：1)減輕炎癥反應，他汀類藥物可通過直接減少體內炎性介質(TNF-α和IL-1β)的表達或抑制NF-κB的活性，從而減輕神經功能損傷。2)抗氧化作用，他汀類藥物具有廣泛的抗氧化作用，減輕腦血管病后的氧化應激反應，從而起到腦保護作用[13]。孟令麗[14]研究發現，阿托伐他汀可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路調控IL-1β介導的炎癥反應，降低腦組織的含水量，改善神經功能損傷，從而減輕腦出血后繼發性神經損傷，對腦出血大鼠起重要的神經保護作用。本實驗Western blot和免疫組化的結果顯示，腦出血后給予阿托伐他汀治療，NF-κB和TNF-α、IL-1β的表達水平較出血組明顯減少，這可能是NF-κB的活性得到明顯抑制，從而導致TNF-α、IL-1β的合成與釋放大量減少，減慢了腦出血組織周圍炎癥反應的進一步發生和發展。所以阿托伐他汀可能通過抗炎途徑抑制炎癥介質的表達，從而起到神經保護作用，這為阿托伐他汀在腦出血的臨床應用提供了理論依據。

[1]Poon M T, Bell S M, Al-Shahi Salman R. Epidemiology of Intracerebral Haemorrhage[J]. Front Neurol Neurosci, 2015, 37: 1-12.

[2] An S J, Kim T J, Yoon B W. Epidemiology, Risk Factors, and Clinical Features of Intracerebral Hemorrhage: An Update[J]. J Stroke, 2017, 19(1): 3-10.

[3]魯華山, 于長義, 田志佳, 等. 腦出血實驗動物模型研究進展[J]. 中華神經外科疾病研究雜志, 2016, 15(2): 184-186.

[4]王哲, 劉震, 劉昕, 等. 兩種實驗性大鼠腦出血模型的對比研究[J]. 第三軍醫大學學報, 2016, 38(13): 1494-1500.

[5]Shih R H, Wang C Y, Yang C M. NF-kappaB Signaling Pathways in Neurological Inflammation: A Mini Review[J]. Front Mol Neurosci, 2015, 8: 77.

[6]Rahman I, Gilmour P S, Jimernez L A,etal.Oxidative stress and TNF-alpha induce histone acetylation and NF-kappaB/AP-1 activation in alveolar epithelial cells: potential mechanism in gene transcription in lung inflammation[J ]. Mol Cell Biochem,2002,234-235(1/2):239-248.

[7]Aggarwal B B. Nuclear factor-kappaB: the enemy within[J]. Cancer Cell, 2004, 6(3): 203-208.

[8]Tilstra J S, Robinson A R, Wang J,etal. NF-κB inhibition delays DNA damage-induced senescence and aging in mice[J]. J Clin Invest, 2012, 122(7): 2601-2612.

[9]Yakovleva T, Bazov I, Watanabe H,etal. Transcriptional control of maladaptive and protective responses in alcoholics: A role of the NF-κB system[J]. Brain, Behavior, and Immunity, 2011, 25: S29-S38.

[10] Yamada Y, Takeuchi S, Yoneda M,etal. Atorvastatin reduces cardiac and adipose tissue inflammation in rats with metabolic syndrome[J]. Int J Cardiol, 2017, 240: 332-338.

[11] Taylor E W, Andrade D V, Abe A S,etal. The unequal influences of the left and right vagi on the control of the heart and pulmonary artery in the rattlesnake, Crotalus durissus[J]. J Exp Biol, 2009, 212(Pt 1): 145-151.

[12] Ewen T, Qiuting L, Chaogang T,etal. Neuroprotective effect of atorvastatin involves suppression of TNF-α and upregulation of IL-10 in a rat model of intracerebral hemorrhage[J]. Cell Biochem Biophys, 2013, 66(2): 337-346.

[13] 姜曉鋒. 阿托伐他汀對永久性大鼠局灶性腦缺血的保護作用及其對腦eNOS表達的影響[D]. 成都：四川大學, 2004：24-26.

[14] 孟令麗. 阿托伐他汀阻抑實驗性腦出血大鼠腦內NF-κB介導的繼發性炎癥損傷[D].石家莊：河北師范大學, 2014：21-32.

TheEffectofAtorvastatinontheExpressionofNF-κB,TNF-αandIL-1βintheRatswithIntracerebralHemorrhage

WuYu1,ZouXianwei2△,ChengRunxia3.

1.ChengduMedicalCollege,SichuanKeyLaboratoryofDevelopmentandRegeneration,Chengdu610500,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;3.SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

ObjectiveTo observe the effect of atorvastatin on the expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β in the tissues around the hematoma of the rats with intracerebral hemorrhage and explore the protective effect of atorvastatin on the brain of the rats with intracerebral hemorrhage and its possible mechanism.MethodsA total of120SD rats were randomly divided into the sham group, intracerebral hemorrhage group and treatment group. Both the intracerebral hemorrhage and treatment groups were given the intracerebral injection of autologous blood to establish the models of intracerebral hemorrhage, while the sham group was given the injection with0.9% sodium chloride at the same site. The treatment group was given intragastric administration of atorvastatin at doses of10mg/kg2hours after operation. The rats were sacrificed and their brain tissues were taken in each group after12hours,1,2,3and5days respectively. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the protein expression of TNF-α, IL-1β, and NF-κB in the brain tissue of rats in each group.ResultsCompared with the sham group, the intracerebral hemorrhage group had significant increase in the expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β (P<0.05), and the expression began to increase steadily after12hours, reached the peak on the3rd day, and lasted for5days. Compared with the intracerebral hemorrhage group, the expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β decreased significantly in the treatment group (P<0.05).ConclusionThe high expression of NF-κB, TNF-α and IL-1β is involved in the tissues around the hematoma of the rats with intracerebral hemorrhage. Atorvastatin has a protective effect on the brain by reducing the expression of NF-κB signaling molecules, the production of inflammatory cytokines and the inflammatory response of brain tissues.

Atorvastatin； Intracerebral hemorrhage； NF-κB；TNF-α；IL-1β

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170719.1840.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.016

四川省教育廳重點項目(No:17ZA0314)

：鄒顯巍 E-mail：chinazxw002@163.com

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