低濃度重金屬離子對脲酶活性的影響

姜叢慧，鄭藝華，胡艷芳，聶兆廣

(1.青島大學 化學化工學院，山東 青島 266071；2.青島大學 機電工程學院，山東 青島 266071)

低濃度重金屬離子對脲酶活性的影響

姜叢慧1，鄭藝華2，胡艷芳1，聶兆廣1

(1.青島大學 化學化工學院，山東 青島 266071；2.青島大學 機電工程學院，山東 青島 266071)

利用量熱技術對脲酶的反應體系進行優化研究，并對各重金屬離子抑制脲酶的活性進行研究。結果表明，在1.2 mL反應體系中，60U脲酶催化尿素時的最佳底物濃度為0.12 mol/L，磷酸緩沖溶液濃度為0.25 mol/L，最佳pH值為7.0。在此優化條件下，同時還發現在一定的重金屬離子濃度范圍內，Cu2+、Pb2+、Hg2+和Cd2+對脲酶有明顯的抑制作用，且呈明顯的線性關系，對脲酶的抑制程度大小為：Hg2+> Cu2+> Cd2+> Pb2+。

脲酶；量熱法；重金屬離子；抑制

脲酶，又稱尿素酰胺水解酶，廣泛存在于各種動物、植物、細菌、真菌和人體中，尤其是豆類中含量最為豐富，其活性中心含有兩個金屬鎳離子，作為輔基對脲酶體系具有重要意義[1]。目前，脲酶存在的主要作用是將尿素變成可供有機體使用的氮源，在自然界氮的新陳代謝過程中扮演著重要角色。通常情況下，尿素極為穩定，不易水解，但是尿素在脲酶催化作用下的水解速率是無催化作用時的104倍[2]。由于脲酶不僅來源廣泛，而且容易提取，所以它的價格低廉，除此之外，脲酶還具有對一些重金屬離子的敏感度高等優點[3-4]。當脲酶活性中心的甲巰基或巰基與重金屬離子結合后，其活性中心的性質與結構就會發生改變，酶的活力也會隨著改變，最終使底物一酶系統中顯色劑的吸光度、pH值、電導率、溫度等都會發生改變，可以借助光信號、電信號和熱信號等加以識別，重金屬離子的含量就可以間接地被檢測出來[5]。

近年來，酶抑制法因其快速簡便、經濟高效等優勢，正迅速地被應用于環境污染和食品安全等方面的檢測研究[6-7]。為了避免副產物、樣品顏色和濁度等干擾因素的影響，本研究中將酶抑制法與簡單易行的量熱法結合起來對重金屬離子溶液進行分析檢測[8-10]，具有潛在的社會效益和較強的實際意義，為監測環境污染提供了良好的判定依據。

1 實驗材料和方法

1.1 供試材料及主要的試劑和儀器

實驗材料主要有來自Sigma-Aldrich公司的脲酶,且配成300U/mL脲酶溶液于4℃下保存。

實驗試劑主要有尿素、十二水磷酸二氫鈉、二水磷酸氫二鈉、硫酸銅、醋酸鉛、硝酸鎘和氯化汞，且皆為市售分析純。

實驗儀器主要有數字貝克曼溫度計、分析天平、微量取樣器等。

1.2 實驗原理

本研究利用的是脲酶催化水解尿素的化學反應，此過程中脲酶能催化尿素水解經中間產物氨基甲酸鹽，最終水解為氨和二氧化碳[2]，同時伴隨著焓變，能量以熱的形式耗散。我們利用此反應的熱效應可以對脲酶的各影響因素進行量熱分析，來提高測量的靈敏度和分辨率；進而對重金屬離子對脲酶的抑制程度進行量熱分析，得出的其中關系可作為重金屬離子定性和定量分析的判斷依據。反應方程式：

1.3 測定方法

1.3.1 優化實驗的測定方法

采用兩個數字式貝克曼溫度計來測定，其中一個測反應溶液的溫度變化，另一個同時測參比溶液的溫度變化，目的是溫度校正，消除環境溫度波動和溶液擴散時溫度波動對測量的影響。反應溶液：在酶促反應之前，尿素溶液和磷酸鹽緩沖溶液的混合溶液的初始溫度為T1，加入0.2 mL脲酶(60U)，經過時間2min后，溫度上升為T2，則反應溶液的溫差為ΔT1(ΔT1=T2-T1)。參比溶液：尿素溶液和磷酸鹽緩沖溶液的混合溶液的初始溫度為T3，然后加入同體積的沒有活性的脲酶或者蒸餾水，這個過程需要與反應溶液同步，2min后溫度為T4，則參比溶液的溫差為ΔT2(ΔT2=T4-T3)。

此過程必須要保溫性能特別好，最好在絕熱條件下測定。那么，脲酶催化尿素分解得到的熱效應為ΔT(ΔT=ΔT1-ΔT2)。

1.3.2 重金屬離子對脲酶抑制率的測定方法

采用數字式貝克曼溫度計來測定。首先用上述方法(1)中測出不含金屬離子溶液的反應體系熱效應為ΔTa；然后在相同的反應條件下用相同方法測定出含有某種重金屬離子溶液的反應體系熱效應為ΔTb。

2 實驗步驟

2.1 優化實驗

2.1.1 最適底物濃度的選擇

分別移取0.5 mL的0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mol/L尿素溶液和0.5 mL 0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.0)于2 mL小試管(套有很厚的保溫棉)中混勻，再加入0.2 mL脲酶(60U)在室溫25℃下按上述方法1.3.1可以測出它們的反應熱效應ΔT，并比較考察底物濃度的影響。

2.1.2 最適磷酸鹽緩沖溶液濃度的選擇

分別移取0.5 mL0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.0)和0.5 mL的0.12 mol/L尿素溶液于2 mL小試管(套有很厚的保溫棉)中混勻，再加入0.2 mL脲酶(60U)在室溫25℃下按上述方法1.3.1可以測出它們的反應熱效應ΔT，并比較考察磷酸鹽緩沖溶液濃度的影響。

2.1.3 最適pH值的選擇

分別移取0.5 mLpH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和0.5 mL的0.12 mol/L尿素溶液于2 mL小試管(套有很厚的保溫棉)中混勻，再加入0.2 mL脲酶(60U)在室溫25℃下按上述方法1.3.1可以測出它們的反應熱效應ΔT，并比較考察酸堿度的影響。

2.2 重金屬離子對脲酶的抑制實驗

2.2.1 Cu2+對脲酶的抑制

配制0、1、2、3、4、5μmol/L銅離子溶液，再分別移取0.1 mL不同濃度的銅離子溶液、0.5 mL的0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.0)和0.5 mL的0.12 mol/L尿素溶液于2 mL小試管(套有很厚的保溫棉)中混勻，再加入0.2 mL脲酶(60U)在室溫25℃下按上述方法1.3.2可以得到反應熱效應ΔT，并研究不同濃度銅離子對脲酶的抑制程度。

2.2.2 Pb2+對脲酶的抑制

配制0、20、40、60、80、100μmol/L鉛離子溶液，同上方法研究不同濃度鉛離子對脲酶的抑制程度。

2.2.3 Hg2+對脲酶的抑制

配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L亞汞離子溶液，同上方法研究不同濃度亞汞離子對脲酶的抑制程度。

2.2.4 Cd2+對脲酶的抑制

配制0、4、8、12、16、20μmol/L鎘離子溶液，同上方法研究不同濃度鎘離子對脲酶的抑制程度。

3 結果與討論

3.1 優化實驗

3.1.1 最佳底物濃度的選擇

不同的底物濃度對反應體系的影響見圖1。

圖1 不同濃度的尿素溶液對反應體系的影響

從圖1可以看出，當尿素溶液的濃度低于0.12 mol/L時，其與分解時的熱效應呈正比關系，此時的酶促反應速度隨著底物濃度的增加而加快；當底物濃度超過0.12 mol/L時，曲線漸漸趨于平緩，底物濃度對其酶促反應的影響變小，原因可能是：(1)60U脲酶在1～2min內最多只能催化60μmol尿素，并釋放出一定的熱量；(2)當底物濃度過大時，有部分酶分子與底物相結合,進一步增加底物濃度也不能提高反應速度。因此，本研究中最佳底物濃度為0.12 mol/L。

3.1.2 最佳磷酸鹽緩沖溶液濃度的選擇

不同磷酸鹽緩沖溶液的濃度對脲酶的影響見圖2。

圖2 不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液的對反應體系的影響

從圖2中可以看出，磷酸鹽緩沖溶液在0.1～0.25 mol/L范圍內，反應的熱效應隨著磷酸鹽緩沖溶液濃度的增加而增加；而當磷酸鹽緩沖溶液濃度過高時，超過0.25 mol/L時，其趨勢呈下降狀態，其原因可能是緩沖溶液的濃度過高反而影響了反應體系環境的穩定性,也可能會對脲酶分子構型產生影響。因此，本研究中磷酸鹽緩沖溶液的最佳濃度為0.25 mol/L。

3.1.3 最佳pH值的選擇

不同的pH值對脲酶的影響見圖3。

圖3 不同pH值對反應體系的影響

從圖3中可以看出，脲酶的適宜條件是偏中性的，當pH值≤7.0時，其熱效應隨著pH值的升高而升高；當pH值≥7.0時，它又隨著pH值的降低而降低。這主要是因為pH值不僅能夠影響脲酶的穩定性，還能影響脲酶與底物的結合，脲酶只有在一定的pH值范圍內才具有最高的活力。因此，本研究中最佳pH值為7.0。

3.2 重金屬離子對脲酶的抑制研究

3.2.1 Cu2+對脲酶的抑制研究

圖4 不同濃度的銅離子溶液對脲酶的影響

從圖4可以看出，當銅離子溶液的濃度在0～5μmol/L時，其對脲酶的抑制率與銅離子濃度呈很好的線性關系，即y=18.2646x+1.2558(x：銅離子溶液的濃度，μmol/L；y：抑制率I，%)，R2=0.9942。

3.2.2 Pb2+對脲酶的抑制研究

圖5 不同濃度的鉛離子溶液對脲酶的影響

從圖5可以看出，當鉛離子溶液的濃度在0～100μmol/L時，其對脲酶的抑制率與鉛離子濃度呈很好的線性關系，即y=0.9583x+2.9492(x：鉛離子溶液的濃度，μmol/L；y：抑制率I，%)，R2=0.9952。

3.2.3 Hg2+對脲酶的抑制研究

圖6 不同濃度的亞汞離子溶液對脲酶的影響

從圖6可以看出，當亞汞離子溶液的濃度在0～1.0μmol/L時，其對脲酶的抑制率與亞汞離子濃度呈很好的線性關系，即y=92.9765x+2.4776(x：亞汞離子溶液的濃度，μmol/L；y：抑制率I，%)，R2=0.9960。

3.2.4 Cd2+對脲酶的抑制研究

圖7 不同濃度的鎘離子溶液對脲酶的影響

從圖7可以看出，當鎘離子溶液的濃度在0～20μmol/L時，其對脲酶的抑制率與鎘離子濃度呈很好的線性關系，即y=4.3701x+0.5910(x：鎘離子溶液的濃度，μmol/L；y：抑制率I，%)，R2=0.9983。

4 結論

本研究利用量熱技術對重金屬離子抑制脲酶的活性進行了研究，發現脲酶的活性受到底物濃度影響的同時，也對其它條件，如緩沖溶液的濃度、pH值等非常敏感。因此，根據脲酶的酶學性質對量熱體系進行了一系列優化，從結果可以看出，在1.2 mL的反應體系中最佳的底物濃度是0.12 mol/L，最適pH值在7.0左右，最佳的磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.25 mol/L。

重金屬離子與酶蛋白側鏈殘基結合而使酶的活性受到一定的影響，不同金屬離子對酶的影響不同，它們對酶的結構和功能所起的作用也不相同。在最佳反應條件下，發現在一定的重金屬離子濃度范圍內，Cu2+、Pb2+、Hg2+和Cd2+對脲酶有明顯的抑制作用，且呈明顯的線性關系，同時還對這幾種重金屬離子對脲酶活性的抑制程度進行了比較：Hg2+> Cu2+> Cd2+> Pb2+。

利用量熱技術能克服副產物、樣品顏色和濁度等干擾因素的缺點，具有較高的靈敏度且易于操作，是重金屬污染檢測的有效手段，對今后的環境檢測和食品安全等方面具有非常重要的實際意義。

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(本文文獻格式：姜叢慧，鄭藝華，胡艷芳，等.低濃度重金屬離子對脲酶活性的影響[J].山東化工,2017,46(11):7-9,12.)

Effects of Low Concentration Heavy Metal Ions on the Activity of Urease

JiangConghui1,ZhengYihua2,HuYanfang1,NieZhaoguang1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Qingdao University,Qingdao 266071,China; 2.College of Mechanical and Electrical Engineering,Qingdao University,Qingdao 266071,China)

The incubated conditions of 1.2 mL reaction system were optimized using the calorimetric method. The relations about the corresponding temperature change with different concentration of the heavy metal ions and the kind of the ions were studied. The results showed that 0.5mL urea(0.12 mol/L) and 0.2mL free urease(60U) were incubated in 0.5 mL phosphate buffer solution(0.25 mol/L, pH7.0), which were found to be the optimum reaction conditions. Under the optimum conditions,it was found that Cu2+, Pb2+, Hg2+and Cd2+had obvious inhibition on urease in a certain concentration range,and there was a significant linear relationship between the concentration of some heavy metal ions and the inhibition rate. The sequence of the inhibition on urease by different heavy metal ions was Hg2+> Cu2+> Cd2+> Pb2+.

urease;calorimetry;heavy metal ions;inhibition

2017-04-11

山東省自然科學基金項目(ZR2014EEM004)；山東省重點研發計劃項目(2015GSF117019)

姜叢慧(1992—)，女，江蘇南通人，在讀碩士研究生，研究方向：生物傳感器；通訊作者：聶兆廣，副教授，研究方向為催化反應工程。

O642.3

A

1008-021X(2017)11-0007-03