硫酸二乙酯誘變螺旋霉素高產菌株的選育

吳 陽，武 培，賴 珅，張九鋒，張小紅

(1.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；2．天方藥業有限公司，河南 駐馬店 463000)

硫酸二乙酯誘變螺旋霉素高產菌株的選育

吳 陽1,2，武 培2，賴 珅2，張九鋒2，張小紅1*

(1.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；2．天方藥業有限公司，河南 駐馬店 463000)

以一株螺旋霉素生產菌株為出發菌株，使用硫酸二乙酯(DES)處理進行誘變，獲得四株效價較高的突變株，其中有一株經過5代后遺傳性狀穩定。該菌株在搖瓶試驗中能提高效價約6.5%左右，發酵生產中能提高放罐效價6%左右，該高產菌株的獲得對提高螺旋霉素發酵生產效率有著重要的意義。

螺旋霉素；DES；誘變

螺旋霉素(Spiramycin)為16元大環內酯類抗生素，于1954年由法國Rhone-Poulenc實驗室從Streptomces ambofaciens的代謝產物中分離而得[1]。為白色或微黃色粉末，微有味；微吸濕；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，難溶于水。螺旋霉素具有強大的體內抗菌作用和抗菌后效應(PAE)，能夠增強吞噬細胞的吞噬作用，其在組織細胞內濃度較紅霉素高，而副作用小于紅霉素?？捎糜谥委熡筛锾m陽性菌和某些革蘭陰性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。螺旋霉素對耐青霉素的致病菌也具有較好的療效，在現代生活中有著廣泛的用途。本實驗以一株螺旋霉素生產菌高產菌株為出發菌株，使用硫酸二乙酯(DES)進行誘變處理，通過搖瓶和放罐培養中的效價檢測，以期篩選獲得高產菌株，為進一步提高螺旋霉素的發酵生產效率提供菌株。

1 材料

1.1 儀器設備

回轉式搖床機、1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、EclipseE200光學顯微鏡(日本Nikon公司)。

螺旋霉素鏈霉菌G215，由天方藥業有限公司提供。

1.3 培養基

斜面培養基(%)：淀粉4.0，黃豆餅粉2，氯化鈉0.2,玉米漿0.7，碳酸鈣0.6，瓊脂2.0；121～123℃滅菌30min。

搖瓶種子培養基(%)：淀粉4.0，黃豆餅粉2，氯化鈉0.2,玉米漿0.7，碳酸鈣0.6；121～123℃滅菌30min。

搖瓶發酵培養基(%)：淀粉5.0，黃豆餅粉2.5，氯化鈉0.6玉米漿1.2，碳酸鈣1.0；121～123℃滅菌30min。

15 L發酵培養基(%)：淀粉5.0，黃豆餅粉2.5，氯化鈉0.6玉米漿1.2，碳酸鈣1.0；121～123℃滅菌30min。

2 方法

2.1 搖瓶種子培養

至2017我省栽培面積為50余萬畝，產量約17萬噸，種植面積居全國第4位。其中修文縣、水城縣、大方縣、福泉市等獼猴桃商品生產基地。目前，我省主栽紅肉品種（“紅陽”獼猴桃）和綠肉品種（“貴長”獼猴桃），此外，還有新種植的黃肉品種（“金圓”獼猴桃）等。獼猴桃的成熟期因其特性而異和地域存在差異，早熟的品種如紅陽獼猴桃一般集中在8月底成熟，中晚熟的品種如“貴長”和“米良一號”均在10月上旬成熟。

溫度(27.5±0.5)℃、時間46 h，搖床轉速220 r/min，濕度45%～60%。

2.2 搖瓶發酵培養

溫度(27.5±0.5)℃、時間120 h，搖床轉速220 r/min，濕度45%～60%。

2.3 15 L發酵培養

溫度(27.5±0.5)℃、時間120 h，起始轉速220 r/min，溶氧≥30%，根據溶氧調整轉速。

2.4 效價檢測方法

采用高效液相色譜法[2],螺旋霉素標準品購自中國藥品生物制品鑒定所。

2.5 DES的誘導過程[3]

(1)取DES原液0.4 mL于無菌試管中，加入少量乙醇使其溶解，再加入0.1 mol/L、pH值7.2的磷酸緩沖液19.6 mL，配制成體積分數為2%的溶液。

(2)用0.1 mol/L、pH值7.2的磷酸緩沖液將G215的新鮮斜面洗下，制成菌懸液，取等體積的2%DES溶液和菌懸液混合。

(3)在27～29℃下振蕩處理20～40min。

(4)誘變處理后加入2%的Na2S2O3溶液0.5 mL終止反應。

(5)將菌懸液以生理鹽水至107/mL涂布平板，經過培養后，挑取單菌落進行篩選[4]。

3 結果與分析

3.1 突變菌株的平均效價

經過搖瓶驗證后共挑出四株效價較高的正突變株其分別為G21532(27℃，50min)，G21557(28℃40min)，G21579(28℃30min)，G21596(29℃30min)其平均效價與對照效價相比結果如表1。

表1 突變菌株的平均效價Table 1 The average titer of mutant strains

3.2 突變菌株經過五代傳遞后的平均效價

將所得的4株正突變株經過五代培養，其各代的平均效價見表2。從表2可以看出G21532和G21579菌株經過三次傳代后遺傳性狀已不穩定，G21596與對照菌相比已無優勢，只有G21557突變株經過五代傳遞后遺傳性況較為穩定，但也略有下降，因此最終選定G21557為一較為穩定的菌株。

表2 突變菌株經過五代傳遞后平均效價對比Table 2 Average titer of the mutant strains after five generations of transmissio

3.3 突變株的穩定性驗證

利用15 L發酵罐對突變菌株G21557進行放罐發酵試驗，以驗證其穩定性，經過三批次平行試驗，其平均放罐效價見表3。從表3可以看出，G21557菌株在15 L發酵罐平均放罐效價較生產菌高出6%左右，且表現穩定。

表3 15 L發酵罐穩定性驗證Table 3 Stability verification of 15L fermentor

4 結論

采用DES在28℃40min誘變，獲得4株效價較高的正突變株，進一步篩選得到一株能夠穩定傳代五代的正突變株G21557，其在15 L發酵罐中的平均放罐效價較生產菌高出6%左右，且表現穩定。

從抗突變株的穩定考察結果顯示，經三代以后穩定性有一定的退化。因此在以后的使用和菌種保藏過程中，要控制在傳代在三代以內，及時做好菌種的分離純化工作，使菌株始終保持在穩定的高產狀態。

[1] 羅 俊,高淑紅,陳長華,等.甲基化試劑對螺旋霉素發酵的影響[J].化學與生物工程,2011,28(5):46-50.

[2] 劉儉國,謝書琴,李翠萍,等.林可霉素發酵中生物氮素的替代作用[J]新課程學習,2012(5):8-9.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2005年版(二部).北京：化學工業出版社，2005：531.

[4] 何建勇. 發酵工藝學[M]. 2版.北京：中國醫藥科技出版社，2009:25.

[5] 賴 珅,李維平,朱義斌,等.紫外線-氯化鋰復合誘變吉他霉素高產菌株的選育[J].廣東化工,2015,42(7):13-14.

(本文文獻格式：吳 陽，武 培，賴 珅，等.硫酸二乙酯誘變螺旋霉素高產菌株的選育[J].山東化工,2017,46(11):49-50.)

山東化工在線投稿官網 http://www.sdchem.net.cn

Breeding of DES Mutagenesis of Spiramycin Producing Strain

WuYang1,2,WuPei2,LaiShen2,ZhangJiufeng2,ZhangXiaohong1*

(1.Northwest A&F University, Yangling 712100,China; 2.Topfond Pharmaceutical Co.,Ltd., Zhumadian 463000,China)

A spiramycin-producing strain was mutated by dealing with diethyl sulfate (DES) in this study. Four hyper-producing mutants were obtained and one of them was still s
Table after five generation. The spiramycin titer produced by this mutant was increased approximate 6.5% in shaking flask cultivation and approximate 6.0% in scale-up fermentation,respectively.The obtained hyper-producing mutant is very significant for enhancing the spiramycin production.

spiramycin;DES;mutagenesis

2017-04-04

吳 陽(1981—)，男，河南駐馬店人，碩士研究生，工程師，主要從事抗生素發酵工作；*通訊作者：張小紅(1968—)，女，陜西商州人，博士，副教授，碩士生導師，副研究員，主要研究方向：經濟植物的組織培養及微體繁殖技術，植物細胞工程與作物遺傳改良。

TQ465.5

A

1008-021X(2017)11-0049-02