西藏青稞品種喜馬拉雅8號低溫處理的SSH-cDNA文庫構建及分析

王玉林，徐齊君，原紅軍，曾興權，尼瑪扎西

(西藏自治區農牧科學院農業研究所/省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩 850002)

西藏青稞品種喜馬拉雅8號低溫處理的SSH-cDNA文庫構建及分析

王玉林，徐齊君，原紅軍，曾興權，尼瑪扎西

(西藏自治區農牧科學院農業研究所/省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩 850002)

為進一步研究青稞低溫抗性相關基因，以喜馬拉雅8號為材料，通過抑制差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)的方法，構建青稞低溫環境下的cDNA文庫，并通過nr及KEGG數據庫對篩選得到的高質量EST序列進行功能注釋。結果發現，對隨機挑選的281個陽性克隆進行測序，獲得209條高質量ESTs序列，其中有117條序列能夠在GenBank庫中比對到同源性較高的基因或蛋白。對上述117條序列進行GO功能注釋及KEGG代謝路徑分析，發現其涉及到植物的基礎物質、能量代謝、光合作用、信號轉導等方面，說明這些基因可能參與了青稞對低溫的抗性反應。

青稞；抑制差減雜交(SSH)；低溫處理；EST

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHK. f.)是禾本科大麥屬禾谷類作物，主要產自中國西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要糧食[1]。在青藏高原地區，由于海拔較高，溫度較低，青稞在發育期往往遭受霜凍、雪、雹等迫害，但其仍能夠很好地生長[2]。因此，西藏青稞在作物耐寒性的研究中是一個很好的遺傳資源庫。發掘青稞耐寒基因并研究其耐寒機制，對后續研究其他作物低溫調控相關基因以及其調控機制具有重要意義。

抑制差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)是由Diatchenko等建立的通過DNA差減雜交和抑制PCR技術相結合高效鑒定和分離克隆差異表達基因的一門技術[3-5]。本研究以青稞喜馬拉雅8號為材料，利用SSH技術，構建青稞在常溫和低溫處理下的差減cDNA文庫，并通過nr及KEGG數據庫對篩選得到的高質量EST序列進行功能注釋，以期為進一步研究青稞低溫抗性相關基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試青稞材料為喜馬拉雅8號，由西藏自治區農牧科學院農業研究所提供。

1.2 低溫處理

將供試材料種子播種于塑料盆缽(170 mm×220 mm)中，在溫室中生長至3葉期后轉移至光照培養箱(PRX-450D,Safe,Ningbo,China)內進行培養。培養條件為溫度20/15 ℃(光/暗)，光周期12 h，光照強度225±25 μmol·m-2·s-1，相對濕度75%。

待幼苗第三葉完全展開時，取部分植株于3/1 ℃(光/暗)的培養箱中冷馴化處理5 d。冷馴化結束后，進行低溫處理，即先在-2 ℃下處理4 h，隨后以2 ℃·h-1的速率降溫至-8 ℃，并在該溫度下黑暗處理18 h，再以2 ℃·h-1的速率升溫至-2 ℃，繼續處理15 h，最后把植株全部轉移至正常溫度的培養箱。

1.3 總RNA的提取及cDNA的合成

待喜馬拉雅8號長至四葉期時，分別選取經低溫處理和常溫處理的葉片，采用Trizol(TaKaRa)法抽提總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質量和濃度，參照Oligotex(Qiagen)的操作方法分離和純化mRNA。根據SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clothtech)操作方法，將mRNA合成cDNA。

1.4 抑制差減雜交及PCR產物的克隆

對1.3中所得cDNA進行純化，并在RsaⅠ酶切下產生比較短的平端片段，便于下一步的接頭連接和差減雜交，具體操作參照PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clothtech)說明書。分別以低溫處理所得cDNA作為driver，常溫處理所得cDNA作為tester，以及以常溫處理所得cDNA作為driver，低溫處理所得cDNA作為tester，進行兩種差減雜交，將兩種差減雜交的第2次PCR產物純化后與pMD-18T(Takara)連接，構建兩個抑制差減cDNA文庫。將連接產物轉化感受態細胞DH5α，涂布于含X-gal/IPTG和Amp的瓊脂平板上，37 ℃培養過夜。隨機挑取200個白色克隆，37 ℃條件下培養5 h以上，取1 μL菌液作模板，用引物Nested primer 1/Nested primer 2R進行PCR檢測，鑒定差減雜交cDNA片段。將鑒定正確的陽性克隆送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性10 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環。

1.5 序列分析

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blastn和Blastx對所得ESTs序列進行同源核苷酸和蛋白序列比對分析，并對所獲得的ESTs序列進行GO功能注釋和KEGG代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 所提取的總RNA和mRNA的質量

上述1.3中所提取的經低溫和常溫處理的葉片總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后發現，大部分RNA集中在18S和28S rRNA區域，且28S的亮度約為18S的1.5～2.0倍，表明所提取總RNA完整性較好(圖1A)。紫外分光光度計檢測OD260/OD280的比值，結果均在1.85～2.10之間，說明總RNA純度較高。純化后的mRNA呈現出彌散狀的亮帶，說明mRNA質量良好(圖1B)。

M:Marker;1：低溫處理；2：常溫處理。圖2中同。

2.2 雙鏈cDNA的合成及RsaⅠ酶切效果

將純化后的兩種mRNA按照SMART cDNA文庫合成的方法合成雙鏈cDNA。取5 μL雙鏈cDNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，片段主要分布于100～2 000 bp(圖 2A)。用RsaⅠ酶切3 h，產物主要集中在100～700 bp(圖2B)，即長片段得到有效地消化，說明酶切效果好。

2.3 差減文庫的構建及鑒定結果

兩次差減雜交得到的差異片段進行2次PCR擴增后，將第2次的產物與pMD18-T連接，構建兩個抑制差減cDNA文庫。從每個差減cDNA文庫隨機挑取200個克隆，用引物Nested primer 1/Nested primer 2R進行PCR鑒定后，分別篩選到145和136個陽性克隆，插入片段長度主要分布于150～500 bp(圖3)。

2.4 ESTs序列分析

對281個陽性克隆進行測序，一共獲得209條高質量ESTs序列。將得到的209條ETSs序列與GenBank的非冗余核酸數據庫和非冗余蛋白數據庫進行同源性比對分析，結果表明，其中66條序列無法比對到同源序列，可能是新基因；117條序列能夠在核酸和蛋白數據庫中有較高的同源性，其中，在大麥、小麥、山羊草、栗米、蒺藜狀苜蓿、二穗短柄草等物種中具有較高的同源性(圖4)。

圖2 雙鏈cDNA(A)及其酶解后(B)的電泳圖譜

M:Marker;A和B分別表示以常溫處理和低溫處理所得cDNA為tester。

根據在nr數據庫中的比對結果，對成功注釋的117條ESTs序列進行GO功能注釋。結果(圖5)發現，這些序列主要在生物學過程、細胞組成及分子功能這三大類功能中被注釋，如在生物學過程中主要在細胞生理生化、生物的代謝過程及組織信號傳遞過程中發揮作用；在細胞組成這一大類中，主要參與構成一些細胞、組織、器官等；同時，在分子功能中主要發揮著結合和催化等作用。

通過與KEGG數據庫的比對，可以分析被注釋的ESTs序列在青稞代謝途徑中的富集情況。利用KEGG數據庫的分類，可以簡單的將被注釋的117條ESTs序列中的101條序列歸類到全部的7大類代謝通路中，其中被注釋到新陳代謝和遺傳信息處理過程的ESTs序列最多，分別有53條(包括氨基酸代謝、其他次生代謝產物的生物合成、碳水化合物代謝、能量代謝、總覽和概述圖、脂質代謝、輔酶和維生素代謝、其他氨基酸代謝、核苷酸代謝)和30條(包括折疊、排序和退化、DNA復制及損傷修復、轉錄、翻譯)，占總注釋ESTs的52.5%和29.7%(圖6)。對注釋到7大類代謝通路的序列作進一步分析發現，其中參與蛋白翻譯、碳水化合物代謝、能量代謝、蛋白折疊修飾的ESTs序列占據主導地位，分別有11、10、11、14條，各占整個注釋的代謝通路的10.89%、9.90%、10.89%、13.86%。將這結果與GO功能注釋的結果進行分析后發現，參與基礎代謝的這些序列在功能上具有一定相關性，并在此證明注釋結果的準確性，同時也可以表明植物對外界環境的適應過程是一個由多系統調控的生物過程。

1：大麥；2：烏拉圖小麥；3：山羊草；4：小麥；5：粟米；6：蒺藜狀苜蓿；7：二穗短柄草；8：玉米；9：歐洲油菜；10：粳稻；11：單粒小麥；12：菜豆；13：煙草；14：霍爾斯單軸霉；15：大豆疫霉菌；16：野生二棱大麥；17：高粱；18：香瓜；19：秈稻；20：三蕊草；21：雷蒙德氏棉；22：直立雀麥；23：鷹嘴豆；24：其他。

1：生物調節；2：組織細胞組成或生物合成；3：細胞生理進程；4：脫毒作用；5：生物發育過程；6：生長進程；7：定位；8：代謝進程；9：多生物進程；10：多細胞生物進程；11：負調控生物進程；12：正調控生物進程；13：生物進程調控；14：繁殖；15：生殖進程；16：刺激反應；17：信號通路；18：有機體信號進程；19：細胞；20：細胞組成；21：胞外區；22：細胞外區域組成；23：大分子復合物；24：細胞膜；25：細胞膜組成；26：膜內腔；27：細胞器；28：細胞器組成；29：病毒體；30：病毒粒子部分；31：抗氧化性；32：結合；33：催化作用；34：分子功能調節；35：核酸結合轉錄因子活性；36：結構分子活性；37：轉錄因子活性、蛋白質綁定；38：轉運活性。

1：運輸和分解代謝；2：信號傳導；3：折疊、排序和退化；4：DNA復制及損傷修復；5：轉錄；6：翻譯；7：內分泌代謝疾病；8：氨基酸代謝；9：其他次生代謝產物的生物合成；10：碳水化合物代謝；11：能量代謝；12：總覽和概述圖；13：脂質代謝；14：輔酶和維生素代謝；15：其他氨基酸代謝；16：核苷酸代謝；17：環境適應性。

3 討 論

已有研究表明，植物對低溫、干旱等一些逆境脅迫環境的響應都是通過信號傳導及基因調控實現的，而在信號傳導過程中，蛋白激酶及鋅指轉錄因子是這一過程的主要成分[6]。如核糖體蛋白激酶，位于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路下游，參與植物對逆境響應蛋白的合成過程[7]。2001年，Kim等[8]在大豆中研究發現，大豆的鋅指環蛋白SCOF-1定位在核內，可以增強SGBF-1與DNA啟動子區順勢作用元件的結合力，提高對冷調節基因的表達，從而增強作物對低溫的抵御能力。除了通過信號轉導過程對植物逆境進行調控外，植物體內的一些活性氧自由基等也可以通過調控生物膜的構成進而對植物逆境調節起到重要作用，如過氧化氫酶(CAT)、金屬硫蛋白等[9-10]。還有研究表明，當植物受到低溫脅迫時，質膜會通過構象的變化，改變細胞膜的通透性，抵御外界環境的變化，同時也會對植物的物質運輸造成一定的影響[11-15]。與此同時，植物對低溫適應機理方面的酶分子多態性的研究成果表明，植物抗低溫水平的變化是與許多酶系統構型變化、同工酶的改組及功能活力的改變有關，如光合作用過程中的關鍵酶丙酮酸磷酸雙激酶，在低溫環境下，其構象會由四聚體結構變為二聚體結構，影響酶的活性變化，從而對植物的碳水化合物代謝過程產生影響[16-20]。在前人研究基礎上，本研究對獲得的ESTs序列，通過NCBI核苷酸數據庫及Blast2GO功能分類注釋，根據細胞組成分析，發現其差異基因主要集中在細胞、細胞膜及細胞器中；根據分子功能分類，所占比例較多的為一些具有結合和催化功能的基因；而在生物學進程中的分類，主要集中在一些基礎代謝及信號傳遞分類中。從以上分析結果可以初步確定，構建的青稞cDNA差減文庫中的部分克隆序列所包含的基因與低溫或其他逆境相關，由此可以確定構建的差減文庫為一個低溫差減cDNA文庫。但是，對所克隆得到的基因的分子功能仍不得而知，我們可以通過分子生物學手段，對目標基因進行分子功能驗證，以期闡明青稞在低溫環境下的分子調控機理。

[1] 郭本兆.青海經濟植物志[M].西寧:青海人民出版社,1987:701.

GUO B Z.Qinghai economic flora [M].Xining:Qinghai People’s Publishing House,1987:701.

[2] 楊 菁,遲德釗,吳昆侖.青藏高原不同生態區栽培措施對青稞產量的影響[J].安徽農業科學,2011,39(24):14573.

YANG Q,CHI D Z,WU K L.Effects of cultivation measures in different ecological areas of Qinghai-Tibet plateau on yield of hulless barley [J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences,2011,39(24):14573.

[3] DIATCHENCO L,LAU Y F,CAMPBELL A P.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1996,93:6025.

[4] 黃 鑫,戴思蘭,孟 麗.抑制性差減雜交(SSH)技術在分離植物差異表達基因中的應用[J].分子植物育種,2006,4(5):735.

HUANG X,DAI S L,MENG L.The application of suppression subtractive hybridization (SSH) on isolating plant different genes [J].MolecularPlantBreeding,2006,4(5):735.

[5] 邱志鵬,王 翀.抑制消減雜交及其應用[J]．生物技術通報,2006(增刊):246．

QIU Z P,WANG C.Suppression subtractive hybridization and it’s application [J].BiotechnologyBulletin,2006(supplement):246.

[6] 沈 漫,王明麻,黃敏仁.植物抗寒機理研究進展[J].植物學通報,1997,14(2):1.

SHEN M,WANG M M,HUANG M R.Advances in research on chilling resistance mechanisms of plants [J].ChineseBulletinofBotany,1997,14(2):1.

[7] SANGWAN V,FOULDS I,SINGH J.Cold-activation ofBrassicanapusBN115 promoter is mediated by structural changes in membrane and cytoskeleton,and requires Ca2+influx [J].PlantJournal,2001,27(1):1.

[8] KIM J C,LEE S H,CHEONG Y H.A novel cold-inducible zinc finger protein from soybean,SCOF-l,enhances cold tolerance in transgenic plants [J].PlantJournal,2001,25(3):247.

[9] BUSH D S.Calcium regulation in plant cells and its role in signaling [J].AnnualReviewofPlantPhysiology&PlantMolecularBiology,1995,46:95.

[10] KNIGHT H,CAMPBELL A K,SMITH S M,etal.Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elictitors on cytoplasmic calcium [J].Nuture,1991,352:524.

[11] HAMADA A,HIBINO T,NAKAMURA T,etal.Na+/H+antiporter fromSynechocystisspecies PCC 6803,homologous to SOS1,contains an aspartic residue and long C-teminal tail important for the carrier activity [J].PlantPhysiology,2001,125:437.

[12] HAMADA A,SHONO M,XIA T,etal.Isolation and characterization of a Na+/H+antiporter gene from the halophyteAtriplexgmelini[J].PlantMolecularBiology,2001,46:35.

[13] STONE J M,WALKER J C.Plant protein kinase families and signal transduction [J].PlantPhysiology,1995,108:451.

[14] 劉 強,張 勇,陳受宜.干旱、高鹽及低溫誘導的植物蛋白激酶基因 [J].科學通報,2000,45(6):561.

LIU Q,ZHANG Y,CHEN S Y.Drought,high salt and low temperature induction of plant protein kinase gene [J].ChineseScienceBulletin,2000,45(6):561.

[15] THOMASHOW M F.Plant cold acclimation:freezing tolerance genes and regulatory mechanisms [J].AnnualReviewofPlantPhysiology&PlantMolecularBiology,1999,50:571.

[16] KELLY G J,LATZKO E.Regulatory as peats of photosynthetic carbon metabolism [J].AnnualReviewofPlantPhysiology&PlantMolecularBiology,1976,27:185.

[17] 吳國訓, 吳田兵, 查寶源, 等.低溫脅迫對刨花楠苗期細胞保護系統及生理生化物質的影響[J].江西林業科技, 2008(4): 14.

WU G X,WU T B,ZHA B Y,etal.Effects of chilling stress on cell protecting system and physiological and bio-chemical properties ofMachiluspauhoiseedlings [J].JiangxiForestryScienceandTechnology, 2008(4): 14.

[18] 馬為民,施定基,王全喜.用基因工程提高光合同化CO2效率的一個關鍵酶-1,6-二磷酸果糖酶[J].生物化學與生物物理進展,2003,30(3):446.

MA W M,SHI D J,WANG Q X.Using genetic engineering to improve the light efficiency of CO2from contracting a key enzyme-1,6 diphosphate fructose enzyme [J].ProgressinBiochemistryandBiophysics,2003,30(3):446.

[19] GUY G L.Cold acclimation and freezing stress tolerance:role of protein metabolism [J].AnnualReviewofPlantPhysiology&PlantMolecularBiology,1990,41:187.

[20] 何 濤.青棵差減文庫的構建及冷誘導基因的克隆和轉基因煙草表達研究[D].西安:西北大學,2007:8-12.

HE T.Construction of subtractive cDNA library and cloning of cold-induced gene in highland barley and expression analysis of transgenic tobacco [D].Xi’an:Northwest University,2007:8-12.

ConstructionandAnalysesofSSHLibraryofTibetanHullessBarley(HordeumvulgareL.var.nudumHK.f.)Ximalaya8underLowTemperatureTreatment

WANGYulin,XUQijun,YUANHongjun,ZENGXingquan,TASHINyima
(Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences/State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement,Lhasa,Tibet 850002,China)

In order to analyze the related genes response to low temperature in barley further,a barley cDNA library under low temperature treatment was constructed using suppression substractive hybridization(SSH),with Ximalaya 8 as research materal.From the cDNA library,we randomly selected 281 positive clones,and sequenced 209 high quality ETSs,of which 117 sequences had homologous genes or proteins when blasted in GenBank.These 117 genes were related to basic material,energy metabolism,photosynthesis and signal transduction by the analysis in nr and KEGG databases.It is indicated that these genes are likely to be involved in the cold tolerance of barley.

Hullless barely; Suppression subtractive hybridization (SSH); Low temperature treatment; EST

時間：2017-08-08

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170808.0911.008.html

2016-12-14

2017-06-18

西藏財政專項(2015CZZX001;Z2016B01N01);國家重點實驗室研究專項(Z2016D03G01)

E-mail：wangyulin8609@126.com

尼瑪扎西(E-mail：nima_zhaxi@sina.com)

S512.3；S330

： A

：1009-1041(2017)08-1025-06