吉非替尼小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究

張 佳，糜志遠，湯媛媛，李 潔

吉非替尼小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究

張 佳1，糜志遠1，湯媛媛1，李 潔2

（1湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；2武昌工學(xué)院食品工程學(xué)院，湖北武漢430065）

研究吉非替尼在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)。方法：小鼠灌胃兩種劑量50及32.5mg／kg后用高效液相色譜法（HPLC）測定不同時間的血藥濃度。色譜條件為Thermo ODS－2HYPERSIL色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為V（甲醇）∶V（水（0.1%三乙胺））＝75∶25體積比，檢測波長為330nm，流速為1.0mL／min。用DAS2.0藥動學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。結(jié)果：吉非替尼血清濃度在1.5～6μg·mL－1內(nèi)線性良好，最低檢出質(zhì)量濃度為20ng· mL－1，高、中、低濃度樣品回收率分別為100.06%，99.85%，100.06%。兩組劑量的吉非替尼在小鼠體內(nèi)的藥時曲線均符合二室模型，主要藥動學(xué)參數(shù)：半衰期分別為20.49h和20.51h。藥時曲線下面積AUC為12.7和8.5mg／（L·h）。表觀分布容積Vd為118.2和113.4L·kg－1。平均駐留時間MRT為25.8h。結(jié)論：該方法選擇性強，方法簡單，能夠準(zhǔn)確測定小鼠給藥后的血藥濃度，對該藥物的臨床血藥濃度檢測和藥代動力學(xué)研究有一定的參考價值。

吉非替尼；藥動學(xué)；高效液相色譜法

肺癌是目前致死率最高的腫瘤疾病之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌發(fā)生率的80%以上，其5a生存率小于15%［1］，吉非替尼（Gefitinib，又名Iressa）作為一種表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制［2－3］，通過抑制腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，促進其凋亡［4－5］，吉非替尼主要是對含鉑類化療失敗的晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）有一定的治療作用，具有分子靶向性，對正常細(xì)胞的毒性小［6－8］。本品在水中溶解性較差（pH＝1時微溶于水），并且對光不穩(wěn)定，據(jù)報道，本品在人體內(nèi)的生物利用度約為59%［9］。

本文主要研究了吉非替尼在小鼠體內(nèi)的分布隨時間的變化，采用高效液相色譜法測定血液中吉非替尼的含量，測定小鼠灌胃（ig）給藥后血液中吉非替尼含量的變化，并求得相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 吉非替尼原料（含量99.8%，湖北興銀河化工有限公司，批號：20151210），吉非替尼對照品（自制），肝素鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，美國Fisher公司），超純水（自制），三乙胺（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）。

1.1.2 儀器 QL－901型旋渦混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠），TGL－16C型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），美國賽默飛Thermo Ultimate 3000型雙三元液相色譜儀，自動進樣器（Thermo）

1.1.3 動物 昆明種小鼠（SPF級，體重20±2g），湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2016－0005。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 準(zhǔn)確取干燥至恒重吉非替尼原藥，用甲醇制成質(zhì)量濃度為500μg／mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，備用。

取小鼠空白血清0.5mL，加入吉非替尼對照溶液1.0mL，按照上述3血清樣品配制方法制備含有吉非替尼的血清樣品，20μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。

取小鼠血漿到已加入0.5mL肝素鈉溶液（1000u／mL）的離心管中，6000r·min－1離心10 min，取上清液1.0mL，加入3.0mL甲醇，旋渦振蕩0.5min，混勻，6 000r·min－1離心，20μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.2 實驗動物 取小鼠180只，體重（20±2）g，雌雄各半，分為2組，每組90只，每個時間點5只，實驗前禁食12h，自由飲水，根據(jù)易瑞沙（吉非替尼片）說明書制定本實驗給藥劑量，第一組灌胃（ig）50 mg／kg，第二組32.5mg／kg，給藥后于0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12，15，18，21，24，27，30，36，48h后摘眼球取血1.0mL，提前加入0.5mL 1000u／mL肝素鈉抗凝，按前述方法配制血清樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定各時間點血藥濃度。

1.2.3 色譜條件 參考文獻［10－11］，最終確定色譜條件為Thermo ODS－2HYPERSIL色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm），流動相為V（甲醇）∶V（水（0.1%三乙胺））＝75∶25［12－13］，檢測波長為330 nm，流速為1.0mL／min，進樣量為20μL，理論塔板數(shù)按吉非替尼峰計算大于5000。

1.2.4 方法專屬性 吉非替尼對照品溶液、吉非替尼血清樣品溶液、空白血清樣品等三種溶液，分別取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.5 最低檢測限與定量限 定量稀釋血清樣品，使其HPLC圖譜中主峰面積的信噪比（S／N）為3.0時樣品的進樣總量作為最低檢測限，S／N為10.0時樣品的進樣總量作為定量限。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取血清0.2mL，分別加入標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按照前述步驟配制樣品，配制濃度分別為0.2、2、4、6、8μg／mL的溶液，用20μm微孔濾膜過濾，各取續(xù)濾液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以吉非替尼濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)做曲線，得到回歸方程。

1.2.7 回收率 將吉非替尼對照溶液加入到空白血清中，按照前述標(biāo)準(zhǔn)血清樣品配制方法，制備4、5和6μg／mL 3種質(zhì)量濃度的血清樣品，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果代入回歸方程后得到其對應(yīng)質(zhì)量濃度，與標(biāo)識的血清樣品濃度相比即為本方法的相對回收率。

1.2.8 精密度 分別配制吉非替尼濃度為4μg／mL，5μg／mL，6μg／mL的含藥血清樣品，分別在1 d內(nèi)測定6組以及連續(xù)5d測定其濃度，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.9 溶液穩(wěn)定性 配制濃度為4μg／mL，5μg／mL，6μg／mL的含藥血清樣品，并在0、1、2、3、6h時間點測定，計算RSD。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

三種溶液的HPLC圖譜見圖1。可見吉非替尼血清樣品與吉非替尼對照品溶液主峰出峰時間一致，且空白血清樣品在主峰處無色譜峰。

圖1 空白血漿、吉非替尼對照溶液和含藥血漿樣品HPLC圖譜

2.2 最低檢測限與定量限

最低檢測限和定量限分別為2ng和4.8ng，其HPLC圖譜如圖2所示。

圖2 HPLC圖譜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）結(jié)果表明，在0.2～8μg／mL的濃度范圍內(nèi)，血清樣品中吉非替尼濃度與主峰面積呈良好線性關(guān)系，可以準(zhǔn)確測定血液中吉非替尼含量，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.5469x－0.0465，R2＝0.9992。

圖3 吉非替尼血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 回收率

回收率結(jié)果見表1，9份模擬樣品平均回收率98.69%。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.5 精密度

結(jié)果3種質(zhì)量濃度樣品日內(nèi)精密度（RSD）為3.6%，日間精密度（RSD）為4.9%（d＝5），日內(nèi)精密度與日間精密度（RSD）均小于15%，符合生物樣品測定要求。

2.6 溶液穩(wěn)定性

將3種質(zhì)量濃度樣品溶液分別在0，1，2，3，4，6小時測定，峰面積的RSD為4.12%，表明樣品溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 藥時曲線及藥代動力學(xué)參數(shù)

根據(jù)各時間點測定的血藥濃度繪制藥－時曲線，將數(shù)據(jù)通過DAS2.0程序擬合，根據(jù)F檢驗和AIC值選擇適當(dāng)?shù)姆渴夷Ｐ停珹IC值越小，擬合度越好，結(jié)果表明口服吉非替尼后小鼠體內(nèi)的動力學(xué)符合二室模型。藥時曲線見圖4。

圖4 小鼠灌胃兩種劑量吉非替尼血液濃度—時間曲線n＝5

根據(jù)非房室模型統(tǒng)計矩參數(shù)的方法，計算主要動力學(xué)參數(shù)（表2）。

表2 灌胃兩種劑量吉非替尼后在小鼠體內(nèi)的動力學(xué)參數(shù)（n＝5，∞±S）

3 討論與結(jié)論

作為一種具有靶向功能的抗腫瘤藥物，吉非替尼在臨床上有一定的治療價值，特別是針對非小細(xì)胞肺癌。本實驗對吉非替尼在小鼠體內(nèi)的動力學(xué)行為進行了研究。根據(jù)本品臨床使用劑量（250mg，每天一次），本研究設(shè)計試驗組劑量為50及32.5 mg／kg兩組，和臨床使用量相對應(yīng)；給藥途徑為灌胃給藥，和臨床使用途徑一致，取樣周期為48h，符合一般藥代動力學(xué)研究的要求。數(shù)據(jù)經(jīng)DAS2.0軟件處理。結(jié)果表明吉非替尼清除相半衰期為約為20h，故臨床上設(shè)計為1次／d給藥；達峰時間（Cmax）比較適中，為3h左右；血漿藥物濃度－時間曲線下面積（AUC）與給藥劑量成正比。本實驗血液樣品處理方法為液液萃取法，可以防止測定過程血液中其他成分（特別是蛋白質(zhì)）的干擾。由于采用高效液相色譜法測定樣品含量，方法專屬性強，最低檢測限為2ng，檢測靈敏度較高，回收率試驗也證明了該方法的可靠性。

綜上所述，該方法選擇性強，操作簡單，能夠準(zhǔn)確測定小鼠的血藥濃度，對該藥物的臨床應(yīng)用有一定的參考價值。

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Study on Pharmacokinetics of Gefitinib in Mice

ZHANG Jian1，MI Zhiyua1，TANG Yuanyuan1，LI Jie2
（1 School of Food and Biological Engineering，Hubei Univ.of Tech.，Wuhan 430068，China，2 School of Food Engineering，Wuchang Institute of Technology，Wuhan 430065，China）

This paper reports a study on the pharmacokinetics of gefitinib in mice.After intragastric administration of gefitinib at two doses of 50and 32.5mg／kg in mice，the plasma concentration at different times were measured by HPLC.The chromatographic conditions were：Thermo ODS－2HYPERSIL column（4.6mm×250mm，5μm）with a mobile phase of methanol－water（0.1%triethylamine）＝（75∶25），detection wavelength was at 330nm，the flow rate was 1.0mL／min.Data were processed with DAS2.0pharmacokinetic software.Results show that the concentration of gefitinib was linear in the range of 1.5～6μg·mL－1.The lowest detectable concentration was 20ng·mL－1.The recoveries of gefitinib were 100.06%，99.85%and 100.06%respectively.The pharmacokinetic parameters of gefitinibin two groups of mice，T1／2is 20.49and 20.51h.The area under the curve AUC（mg·L－1·h－1）was 12.7and 8.5.The apparent distribution volume Vd（L·kg－1）was 118.2and 113.4.The average residence time MRT（h）was 25.8.It is concluded that the method has the advantages of high selectivity，simple，accurate and has certain reference value for the clinical blood drug concentration detection and pharmacokinetic study.

Gefitinib；Pharmacokinetics；HPLC

R962

A

［責(zé)任編校：張 眾］

1003－4684（2017）04－0087－04

2017－05－24

張 佳（1987－），男，陜西眉縣人，工學(xué)碩士，湖北工業(yè)大學(xué)實驗師，研究方向為藥物制劑開發(fā)

糜志遠（1963－），男，湖北武漢人，湖北工業(yè)大學(xué)副教授，研究方向為藥物開發(fā)應(yīng)用