轉化生長因子-β1誘導腎小管上皮細胞老化及其作用機制的研究

轉化生長因子-β1誘導腎小管上皮細胞老化及其作用機制的研究

孫晗趙亞亞裴小華趙衛紅

目的本研究旨在明確轉化生長因子-β1(TGF-β1)與腎臟老化之間的關系并初步探討其作用機制。方法體內實驗:自然狀態下不同年齡段C57小鼠通過腎臟免疫組化、蛋白改變來驗證小鼠腎臟內TGF-β1表達隨增齡發生的變化。體外實驗:不同濃度的TGF-β1刺激腎小管上皮細胞48 h,觀察老化指標改變,并用其抑制劑Decorin進行干預驗證。結果體內實驗中,小鼠腎臟內TGF-β1的表達隨增齡而增加,幼齡組表達量很少或無表達;體外實驗中,20 ng/ml TGF-β1可明顯誘導腎小管上皮細胞老化,其中β-半乳糖苷酶、p53、p16等老化相關蛋白表達量均顯著增加;而加入TGF-β1抑制劑Decorin干預組,Smad2、Smad3及p53、p16蛋白表達減少,Smad7蛋白表達增加。結論TGF-β1在老化腎臟中表達顯著增加;其可能主要通過激活其下游信號分子Smad2、Smad3,抑制Smad7來激活腎小管上皮細胞肌纖維細胞轉分化的作用,繼而促進了老化相關纖維化的發生。

轉化生長因子-β1; 腎臟老化; 腎小管上皮細胞

老齡化已成為2l世紀不可逆轉的世界性趨勢。據預測,到2037年我國老齡人口將達4億。腎臟是受老化影響最明顯的器官之一[1]。已知腎臟老化以腎小球硬化和腎間質纖維化為主要表現,而作為經典的致纖維化因子轉化生長因子-β1(TGF-β1)是否在腎臟老化中同樣發揮調節作用,且其作用機制如何,目前尚無定論。

因此,本研究分別從體內、外構建老化模型,探索TGF-β1與腎臟老化之間的關系及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎近曲小管上皮細胞HK-2(美國ATCC公司)。實驗動物:健康無特定病原體(healthy specific pathogen-free，SPF)級C57BL6/J小鼠(南京大學模式動物研究中心,體質量16～30 g)。

1.2 方法

1.2.1 分組

1.2.1.1 不同年齡分組:(1)6周齡組(6W);(2)3月齡組(3M);(3)7月齡組(7M);(4)11月齡組(11M);(5)15月齡組(15M);(6)19月齡組(19M)。

1.2.1.2 TGF-β1誘導HK2細胞老化分組:(1)HK2組,即本實驗的對照組;(2)HK2+檸檬酸緩沖液(CB)組;(3)HK2+TGF-β1(10 ng/ml)組;(4)HK2+TGF-β1(15 ng/ml)組;(5)HK2+TGF-β1(20 ng/ml)組;(6)HK2+TGF-β1(40 ng/ml)組。

1.2.1.3 TGF-β1誘導HK2細胞老化的機制研究分組:(1)HK2組,即本實驗的對照組;(2) HK2+CB組;(3) HK2+TGF-β1(20 ng/ml)組,即老化模型組;(4) HK2+TGF-β1(20 ng/ml)+Decorin 組,即 TGF-β1抑制劑組。

1.2.2 HK2細胞增殖實驗:HK2細胞制成均勻懸液(細胞數量106/ml),在96孔板中接種細胞懸液100 μl/孔,將培養板在培養箱預培養24 h(37 ℃、5%CO2),隨后按照10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml濃度梯度加入TGF-β1。

對照組加入相應體積的PBS,不同TGF-β1濃度設立5個復孔,將96孔板放入細胞培養箱中分別共培養48 h和72 h。取出后向每孔加入10 μl CCK-8溶液,將96板在培養箱中孵育3 h,用酶標儀測定在450 nm處的吸光值。

本實驗主要以此方法篩選出適宜的濃度和時間范圍。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色:將HK2細胞懸液接種于放置有玻片的6孔板中,按照不同濃度梯度加入TGF-β1。對照組加入相應體積的PBS,培養48 h,PBS漂洗2次。用含2%多聚甲醛和0.2%戊二醛在4 ℃固定5 min,然后用含1 mol/L MgCl2的PBS漂洗2次,加入SA-β-gal染色液在37 ℃孵育48 h。PBS漂洗終止反應,用伊紅套染未著色細胞胞漿。

1.2.4 western blot檢測各組蛋白水平的表達:各組分別取20 μg蛋白,進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后電轉移至0.22 μm的PVDF膜上。5%的牛奶封閉2 h,分別用p53(1∶500;Abcam)、p16(1∶500;Abcam)、Smad2(1∶500;Proteintech)、Smad3(1∶500; Proteintech)和Smad7(1∶500; Proteintech)一抗4 ℃孵育過夜,洗膜后,以1∶10000稀釋的羊抗兔生物素標記二抗,室溫孵育2 h,再次洗膜。ECL底物化學發光(Multi Sciences)顯色后機器掃描存盤,以Tanon Gis軟件進行條帶分析。

1.2.5 免疫組織化學檢測TGF-β1蛋白水平:采用SABC免疫組化試劑盒(SA1022),購自武漢博士德公司。石蠟切片,二甲苯脫蠟至水,抗原修復,BSA封閉,TGF-β1(Proteintech)一抗工作液濃度為1∶200,采用DAB顯色,蘇木素復染后,逐級脫水,中性樹膠封片。片中出現棕黃色顆粒為陽性結果,每組染色均設以PBS代替一抗作陰性對照。

2 結果

2.1 TGF-β1在不同年齡組小鼠中的自然表達情況

注:與6周齡組比較,*P<0.05,***P<0.001。圖1 TGF-β1在不同年齡組小鼠腎臟中的表達

western blot結果顯示: TGF-β1蛋白表達在11月齡后開始明顯上升,19月齡時表達量最大,顯著高于6周齡組(P<0.05)(圖1)。免疫組化結果顯示:隨著小鼠月齡不斷增加,棕褐色物質表達亦增加,且呈時間依賴性;月齡最大組在腎小管上皮細胞中表達明顯增加,見圖2。

圖2 不同年齡組小鼠腎臟 TGF-β1的表達(×400倍)

2.2 TGF-β1誘導HK2細胞老化實驗結果

2.2.1 誘導HK2細胞老化實驗的濃度和時間:適宜TGF-β1濃度(10～20 ng/ml)刺激HK2細胞48 h后,HK2細胞在450 nm處吸光值隨著TGF-β1濃度增加呈現輕度下降趨勢,但當TGF-β1濃度超過20 ng/ml時,HK2細胞在450 nm處吸光值明顯下降(P<0.001)。 TGF-β1濃度超過10 ng/ml刺激HK2細胞72 h后,HK2細胞在450 nm處吸光值呈明顯下降趨勢(圖3)。因此,確定使用10～40 ng/ml濃度的TGF-β1刺激48 h,以誘導HK2細胞進行老化實驗。

圖3 HK2細胞經不同濃度 TGF-β1刺激48、72 h后生存曲線

2.2.2 光鏡下細胞形態改變:(1)在10～20 ng/ml濃度的TGF-β1刺激HK2細胞48 h后,可見HK2細胞正常形態消失,變為肥大、長梭形樣的成纖維細胞形態,細胞上清中飄漂樣死亡細胞增多, TGF-β1濃度為40 ng/ml時HK2細胞凋亡現象更為明顯(圖4)。

(2)HK2細胞經在10～20 ng/ml TGF-β1刺激48 h,β-半乳糖苷酶染色后可見,表達β-半乳糖苷酶的細胞數隨濃度增加而增多,且呈劑量依賴性(圖5);當 TGF-β1濃度為40 ng/ml時,β-半乳糖苷酶因HK2細胞的減少而降低。

注:A、B示正常組HK2細胞,細胞形態良好,C、D、E、F示隨著 TGF-β1濃度增加,細胞凋亡逐漸增多,間隙增大,損傷程度遞增,細胞老化明顯;與HK2組比較,***P<0.001。圖4 HK2細胞經 TGF-β1刺激48 h培養后光鏡下形態(×100倍)

注:A、B示正常組HK2細胞,表達β-半乳糖苷酶的HK2細胞比率較少,C、D、E、示隨著 TGF-β1濃度增加,胞漿中黃綠色物質明顯增多。F示胞漿中黃綠色物質較E減少。圖5 HK2細胞經 TGF-β1刺激48 h培養后β-半乳糖苷酶染色(×100倍)

2.2.3 western blot檢測HK2細胞老化時p53、p16的蛋白水平變化:western-blot結果顯示,HK2對照組低表達p53、p16蛋白;經不同濃度TGF-β1刺激48 h后,HK2細胞內p53、p16蛋白表達較對照組均增加,尤以20 ng/ml組與對照組差異顯著(P<0.05)(圖6);而40 ng/ml組中因HK2細胞凋亡較多,蛋白表達也隨之減少。

2.3 加入TGF-β1抑制劑后蛋白變化 western blot檢測HK2細胞老化時下游信號分子蛋白水平變化,結果顯示,HK2組低表達Smad2、Smad3及p53、p16蛋白,高表達Smad7蛋白;HK2+TGF-β1組(20 ng/ml)HK2細胞內Smad2、Smad3及p53、p16蛋白表達較對照組顯著增加,Smad7蛋白表達降低;而加入 TGF-β1抑制劑Decorin后,Smad2、Smad3及p53、p16蛋白表達量較HK2+TGF-β1組下降,Smad7蛋白表達增加,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

注：與對照組比較,*P<0.05圖6 HK2細胞經 TGF-β1刺激48 h培養后P53、P16表達

注：與HK2+TGF-β1組比較,*P<0.05圖7 老化HK2細胞加入 TGF-β1抑制劑Decorin后下游信號分子蛋白水平變化

3 討論

老化是指生物發育成熟后,隨著年齡的增加,自身機能減退,內環境穩定能力與應激能力下降,結構、組分逐步退行性變,趨向死亡的不可逆轉的現象[2]。腎臟衰老近年得到了國內外研究者的重視。在40歲以后,大多數人群的腎小球濾過率即以每年1ml/min的速度遞減[3]。

腎臟老化在組織形態學上,主要表現為局灶節段性腎小球硬化,伴毛細血管袢喪失、系膜基質增多和基底膜增厚;腎小管間質纖維化,管腔增大,單核細胞浸潤等[4]。同時,細胞老化現象也日益突出,主要表現為端粒縮短、多種衰老相關基因表達異常,如老化相關β-半乳糖苷酶表達增加,細胞周期阻滯,復制能力下降,老化相關異染色質灶形成,p53、p21和p16 等細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子表達增多等[5]。可見,腎臟老化是以腎小球硬化和腎間質纖維化為主要特征,與各種原因導致的腎臟慢性病變病理學特征相同。

TGF-β作為經典的致纖維化因子,是一組可調節細胞生長和分化的超家族。TGF-β1是TGF-β的一個亞型,在哺乳動物體內分布廣泛,與腎臟疾病密切相關。本課題組及多項前期研究發現,TGF-β1表達增加可促進腎小管間質纖維化;而抑制其與受體結合,可減緩實驗性纖維化程度[6-7]。同時, TGF-β1還有增加細胞外基質含量、調節腎臟細胞增殖和分化及破壞腎小球濾過屏障等作用[8]。新近研究發現,TGF-β1其基因多態性可能與老化、長壽及老年相關性疾病的發生發展有關[9]。

Smads作為TGF-β1胞內信號傳導蛋白家族, 是目前細胞內唯一的TGF-β1受體直接作用底物,亦是介導配體與受體作用的信號，并由胞漿傳至胞核。Sato等[10]對Smad3基因敲除小鼠模型的研究中發現 TGF-β1的致纖維化作用是由Smad3介導的。在缺乏Smad3的小鼠模型中發現,炎性細胞和成纖維細胞不能被 TGF-β1所趨化,進而抑制小管上皮細胞肌纖維細胞轉分化和膠原的分泌,以及纖溶酶原激活抑制劑和金屬蛋白酶組織抑制因子的表達。此外,Wang等[11]用超聲法將Smad 7 基因轉入小鼠體內,發現Smad2和Smad3的活化被抑制,肌成纖維細胞的聚集減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原的生成也減少,這表明TGF-β1/Smad信號通路是導致進展性腎間質纖維化的關鍵通路,且主要受Smad2和Smad3的正向調節和Smad7的負向調節。由上可知,Smad2、Smad3和Smad7是TGF-β1實現其調節腎臟功能的主要下游信號分子。因此,有效切斷TGF-β1的信號轉導,是終止和減輕腎臟病變的關鍵[12]。而新近研究發現,TGF-β1的天然抑制劑Decorin主要通過Smad2、Smad3和Smad7途徑來抑制TGF-β1活性,是TGF-β1活性的一種負反饋調節因子。進而,我們猜測,TGF-β1是通過上述途徑來實現對腎臟老化的調節。

因此本研究結合上述理論基礎,分別從體內外探討TGF-β1與腎臟老化的關系。動物實驗表明,小鼠腎臟內TGF-β1的表達隨增齡而增加,幼齡組表達量很少或無表達,證實了TGF-β1與腎臟老化的發生發展密切相關,其可能主要以老化相關性纖維化調節腎臟老化進程;進一步在體外實驗中,TGF-β1可誘導腎小管上皮細胞老化,其中β-半乳糖苷酶、p53、p16等老化相關蛋白表達量增加,且隨著TGF-β1濃度及時間的增加,老化現象越明顯;此外,在經TGF-β1誘導的老化腎小管上皮細胞內加入TGF-β1抑制劑Decorin后,Smad2,Smad3表達減少,Smad7表達增加,且p53、p16等老化相關蛋白表達量呈一定程度減少,初步證實了TGF-β1可能主要通過激活其下游信號分子Smad2、Smad3,抑制Smad7來誘導小管上皮細胞肌纖維細胞轉分化的作用,繼而促進了老化相關纖維化的發生。

另外,TGF-β1也可能從以下三個方面調節細胞周期,進而影響細胞老化。(1)作為TGF-β1調節生長抑制因子的靶蛋白-CDK4，TGF-β1可通過抑制其翻譯來使表達下調,從而調控細胞周期。(2)TGF-β1通過調節CDK2-cyclinE活性,誘導靶細胞可逆地阻滯在G1期。(3)TGF-β1還可調節p15、p16和p27等抑制蛋白的表達進而影響細胞周期[13]。由此可見,TGF-β1通過多種機制參與腎臟的老化過程。

綜上,本研究結合TGF-β1與老化研究的新進展,明確TGF-β1與腎臟老化之間的關系與聯系,并初步探討了TGF-β1促進腎臟老化的作用機制,進而為防治腎臟老化所引起的相關疾病提供了一定的理論基礎。

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Mechanismsoftransforminggrowthfactor-β1inducedaginginHK2cells

SUNHan,ZHAOYa-ya,PEIXiao-hua,ZHAOWei-hong.

DivisionofNephrology,DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

ObjectiveTo investigate the relationship between transforming growth factor(TGF)-β1 and aging kidney, and to explore its possible mechanism.MethodsThe expression of TGF-β1 in kidney was examined by immunohistochemistry in different age groups of C57 mice. In vitro,by observing the changes of aging indicators, renal proximal tubular epithelial cell line (HK2)were stimulated with different concentrations of TGF-β1 for 48 hours or 72 hours,and intervened with TGF-β1 inhibitor.ResultsThe expression of TGF-β1 in the kidneys was increased with aging, but was little in young mice; The expression of β-galactosidase, p53, p16 and other aging-related protein were obviously increased in HK2 cells which were induced with 20 ng/ml TGF-β1. After the intervention of TGF-β1 inhibitor Decorin, the expression of Smad2 and Smad3 was decreased, Smad7 increased, while p53, p16 and other aging-related protein expression were reduced to some extent.ConclusionsTGF-β1 is significantly increased in aging kidney. It may activate the downstream signaling molecules Smad2, Smad3, inhibiting Smad7 to activate HK2 cells in myofibroblast transdifferentiation, and then promote the development of aging-related fibrosis.

transforming growth factor-β1; renal aging; renal tubular epithelial cells

國家重點基礎研究發展計劃(2013CB530803);國家自然科學基金面上項目(H0511-81370843;H0511-81670677);江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(JX10231801)

210029江蘇省南京市,南京醫科大學第一附屬醫院老年腎科

趙衛紅,Email:zhaoweihongny@njmu.edu.cn

R 692

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.09.007

2017-04-05)