實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠閃光視網膜電圖的改變

劉正峰+郭大東+李姣

[摘要] 目的 觀察實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠閃光視覺誘發電位（F-VEP）和閃光視網膜電圖（F-ERG）的改變。 方法 選取雌性Lewis大鼠（6～8周）12只，采用隨機數字表法分為對照組和實驗組，各6只。實驗組大鼠后肢足底、兩側腹壁和軀干上皮下各注射含有光感受器間維生素A類結合蛋白（IRBP，1177-1191）和結核菌素（TB）的完全弗氏佐劑（CFA）乳化液，對照組大鼠不做處理。EAU大鼠模型制備8 d后，用眼底光學相干斷層成像術（OCT）、眼底熒光素造影（FFA）及F-VEP和F-ERG等手段觀察眼底病變情況。 結果 與對照組大鼠相比，實驗組大鼠免疫后第8天眼底彩照、OCT及FFA等檢查結果均無明顯變化。兩組F-VEP結果差異無統計學意義（P > 0.05）；而與對照組大鼠相比，實驗組大鼠F-ERG有顯著改變，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 免疫后第8天，EAU大鼠視網膜電圖已經發生改變，表明EAU大鼠視網膜細胞已經受到損害。

[關鍵詞] 實驗性自身免疫性葡萄膜炎；眼底光學相干斷層成像術；眼底熒光素造影；閃光視覺誘發電位；閃光視網膜電圖

[中圖分類號] R773 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the changes of flash visual evoked potential （F-VEP） and flash electroretinogram （F-ERG） in experimental autoimmune uveitis （EAU） rats. Methods 12 female Lewis rats （6-8 weeks old） were randomly divided into the control group and the experimental group with a random number table method. Each group included 6 rats. EAU models were induced by injection of interphotor-eceptor retinoid binding protein （IRBP， 1177-1191） supplemented with complete Freund adjuvant （CFA） and tuberculin （TB） at footpads， napes and back of the body； while another 6 rats without any treatment were used as normal controls. After EAU induction for 8 days， both EAU and control rats were examined by Fundus， fundus fluorescein angiography （FFA）， optical coherence tomography （OCT）， F-VEP and F-ERG techniques， respectively. Results Compared with those in control group， the results of rats in EAU group determined by fundus photograph， OCT and FFA had no apparent alterations after induction for 8 days， and no significant difference in F-VEP measurement was found between the two groups （P > 0.05）， however， there was a significant difference for the result of F-ERG between EAU and control groups （P < 0.05）. Conclusion The F-ERG in EAU rats has been apparent changed after EAU induction for 8 days， indicating that the retinal cells have been damaged.

[Key words] Experimental autoimmune uveitis； Optical coherence tomography； Fundus fluorescein angiography； Flash visual evoked potential； Flash electroretinogram

葡萄膜炎是一類主要由T淋巴細胞介導的、可引起視力嚴重損害的眼科疾病[1]，其導致的盲多為不可治盲[2]，因而給社會和家庭造成了嚴重的負擔[3]。臨床研究發現，自身免疫應答可以導致絕大多數的葡萄膜炎[4]。由于人體病理取材研究的困難性，因此，研究人員在體外建立了葡萄膜炎的內源性動物模型——實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）[5]。EAU是以特異性的抗原來免疫敏感品系動物誘導產生的一種組織特異性自身免疫性疾病，誘導的病變主要位于葡萄膜和視網膜，是實驗最常用的人類后葡萄膜炎模型，與Vogt-小柳原田（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH）綜合征、人類交感性眼炎和眼結節病等有相似的臨床和病理特征[6]。1968年，Wacher和Lipton首先創立了EAU的動物模型[7]。EAU是一種成熟的與人類葡萄膜炎相似的動物模型[8]，可以通過幾種視網膜抗原被誘導，其中視網膜光感受器間維生素A類結合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP）和S抗原（S-antigen，S-Ag）是實驗室常用的免疫用特征抗原[9]。本文應用IRBP抗原成功誘導了大鼠葡萄膜炎動物模型，并通過眼底彩照、OCT、FFA及F-VEP和F-ERG等技術手段對EAU大鼠發病后眼底的改變情況進行了初步研究，現報道如下：endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

健康雌性Lewis大鼠，鼠齡為6～8周，購自北京維通利華公司，動物合格證號：NO.11400700037148，水糧充足，12 h光照、12 h黑暗于SPF潔凈系統密閉環境中飼養。所有動物實驗均符合ARVO對于動物在眼睛和視覺方面應用的要求。每2只大鼠飼養于一籠。結核菌素（Tuberculin，TB）購于美國Difco公司；完全弗氏佐劑（complete Freund adjuvant，CFA）購于美國Sigma公司；IRBP（1177-1191，氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV）由上海生工生物公司合成。實驗動物的使用和飼養均遵循ARVO關于眼科研究動物實驗的要求。

1.2 動物分組及EAU大鼠的誘導

實驗分為對照組和實驗組，每組大鼠均為6只。EAU模型的制備參照文獻[10-11]方法進行。簡言之，在Lewis大鼠的后肢足底、兩側的腹壁和軀干上皮下各注射100 μL完全乳化的含有35 μg TB和35 μg IRBP的CFA。對照組注射不含IRBP多肽的TB和CFA溶液。所有實驗均在免疫后第8天進行。

1.3 對Lewis大鼠眼底照片、OCT和熒光造影檢查

各組大鼠實驗前10 min滴加復方托吡卡胺散瞳，再在角膜表面滴加氧氟沙星滴眼液，然后腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉。肌肉松弛情況通過檢查四肢是否有抵抗進行判斷。將大鼠固定于Micron Ⅳ小動物眼底成像系統儀器小鼠XY調節托盤上，調節高度使眼球對準顯微鏡頭，1檔拍攝明場照片。腹腔注射熒光素鈉注射液0.2 mL，2檔拍攝眼底熒光造影。眼底明場、眼底熒光造影同步拍攝Micron Ⅳ OCT造影檢測視網膜厚度。

1.4 F-VEP檢查

在完全暗室條件下，對照組和實驗組大鼠首先暗適應半小時，然后采用全視野內閃光刺激器給予強度2 cd/sm2、頻率2.0 Hz的光刺激，通頻帶為1～100 Hz，疊加次數64。參考電極置于大鼠嘴里，作用電極不銹鋼針直接刺于大鼠枕部兩耳連線中點皮下，接地電極刺于大鼠右前肢皮下。試驗時，向上的P1波和向下的N1波波形和潛伏期均非常穩定，重復性好，在每只大鼠每只眼睛固定出現。N2波在部分大鼠不是很清晰，故本實驗僅對P1波和N1波進行分析。將一只眼睛用黑布完全遮蓋，另一只眼睛進行檢查，并記錄。以每只大鼠每只眼睛兩次檢查所得均值確定其潛伏期和波幅的99%正常值范圍（雙側屆值）。潛伏期、波幅分別以ms、μV為單位。

1.5 F-ERG檢查

在完全暗室條件下，對照組大鼠和實驗組EAU大鼠首先暗適應3 h以上，實驗前10 min滴加復方托吡卡胺散瞳，然后將大鼠固定于Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系統儀器托盤上，在角膜表面滴黏彈劑，參考電極和接地電極由不銹鋼針制成，記錄電極為0.2 mm銀-氯化銀制成的環形電極，尾部、左側頰部和左眼角膜表面分別安放接地電極、參考電極和記錄電極，采用Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系統進行最大反應（max-response）、振蕩電位（oscillatory potentials，OPs）、桿細胞反應（rod-response）、20 Hz閃爍反應（20 Hz-flicker response）記錄和明適應視網膜電圖（photopic electroretinograph，pho-t ERG）。桿細胞反應光強為0.011 cd/sm2，pho-t ERG、OPs和20 Hz閃爍反應光強為3.5 cd/sm2。記錄ERG的通頻帶為1～300 Hz，OPs為100～300 Hz。pho-t ERG和20 Hz閃爍反應之前進行10 min的明適應（明適應光強37 cd/sm2）。觀察ERG a波、b波、OPs波和20 Hz閃爍反應P1波潛伏期和幅值的變化。應用Micron Ⅳ Ganzfeld ERG系統進行波形幅值和潛伏期的測量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 眼底彩照

兩組大鼠的眼底彩照未見明顯差異。見圖1。

2.2 眼底熒光造影和OCT

對照組與實驗組均未見明顯熒光的滲漏，OCT也未見明顯變化。見圖2。

2.3 兩組F-VEP和F-ERG比較

對照組和實驗組大鼠均可引出典型波形呈N-P-N形狀，F-VEP的P1波和N1波波形和潛伏期穩定，重復性好。對照組和實驗組P1波和N1波振幅差值差異無統計學意義（P > 0.05）。F-ERG中，對照組和實驗組大鼠a波和b波的振幅差值分別為（72.86±6.63）μV和（43.98±13.34）μV，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖3～4。

3 討論

VEP已經可以成熟運用于多種動物模型視神經功能的測定，在視神經缺血[12]、視神經損傷[13-14]、EAE等模型[15]中均有報道。VEP檢測易受儀器、麻醉深度、電極放置位置、瞳孔大小、刺激參數、溫度、環境亮度等因素影響，因而各研究機構所得正常參考值差異較大。本實驗中嚴格規定了溫度、亮度電極位置等參數，使實驗誤差盡量減少。結果顯示，實驗組與對照組F-VEP差異無統計學意義，說明EAU大鼠的視神經沒有受到損傷。

ERG是受閃光或模式圖形刺激時從角膜電極記錄到的視網膜總和電反應，即由閃光刺激引起視網膜各級神經元電活動的綜合反應，是從視網膜的細胞水平來評價視神經功能，可反映視網膜各個層次細胞功能狀態的客觀檢查。ERG的a波起源于視網膜光感受器內段，是一種超極化動作電位，可以反映光感受器細胞的生物電活動[16]。ERG的b波一般認為起源于視網膜Müller細胞或雙極細胞[17]，其變化可以反映視網膜內核層細胞（主要是雙極細胞）的電活動，在視網膜功能的診斷上是一個可靠而靈敏的客觀指標。本實驗中，EAU大鼠的a波與b波振幅明顯降低，說明視網膜的細胞已經受到了損害。endprint

OCT具有非侵入性、非接觸性等特點，有高分辨率的組織斷層成像優勢[18]，可以起到與組織病理學觀察結果相一致的作用。目前，OCT已經被應用于EAU小鼠視網膜微結構的破壞成像[19]。本實驗應用OCT對葡萄膜炎大鼠的眼底進行相關檢查，以明確葡萄膜炎大鼠眼底的改變情況。

臨床實踐中筆者發現，雖然葡萄膜炎的患者在治愈以后的客觀檢查中眼底并未發現實質性改變，但是視力卻未能提高。本實驗研究發現，葡萄膜炎大鼠的ERG發生了明顯改變，而FFA、OCT和VEP沒有變化，說明葡萄膜炎的發生發展可能影響了大鼠的視網膜細胞的功能。筆者在此前的研究中，應用透射電子顯微鏡觀察發現，Müller細胞中出現髓樣小體和RPE細胞中出現線粒體空泡[20]。EAU大鼠ERG的改變，Müller細胞和RPE細胞的受損，可以解釋前葡萄膜炎患者在經過治療后，視力仍然不能恢復到正常的原因。

本研究對IRBP（1177-1191）抗原和TB、CFA誘導的EAU大鼠的眼底病變特點進行了分析，在Lewis大鼠免疫誘導后第8天出現了F-ERG的改變，說明EAU大鼠的視網膜細胞已經受到了損害，該結果可以解釋臨床上相應的葡萄膜炎患者的癥狀及病程進展情況。

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（收稿日期：2017-02-24 本文編輯：程 銘）endprint