消痰散結方對結腸癌干細胞樣細胞凋亡的影響及相關機制研究

周昱岐+張映城+魏品康

[摘要] 目的 探討消痰散結方對結腸癌干細胞樣細胞（CCSCs）凋亡的影響及相關機制。 方法 采用無血清培養法由HCT116結腸癌細胞誘導培養CCSCs，通過檢測CCSCs標志物CD44進行鑒定。消痰散結方浸膏凍干粉末溶解在細胞培養液中，制備消痰散結方保存液。以不同濃度消痰散結方（0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL）作用CCSCs 72 h，Annexin-V/PI雙染色結合流式細胞術檢測各濃度消痰散結方對CCSCs的影響。Western blot檢測藥物干預后Bax、Bcl-2蛋白表達變化。 結果 HCT116細胞在無血清培養下成球生長，CCSCs中CD44+細胞占（49.69±1.89）%。消痰散結方可誘導CCSCs，其凋亡率與對照組（0 mg/mL）比較，差異有統計學意義（P < 0.05），其凋亡效應呈濃度依賴性。消痰散結方作用后，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax表達增強，抑凋亡蛋白Bcl-2表達減弱，以0.5、1.0 mg/mL兩組濃度效應更為顯著。 結論 從HCT116結腸癌細胞成功誘導富集CCSCs，消痰散結方能劑量依賴性地誘導CCSCs，其機制可能與促凋亡蛋白Bax表達增強、抑凋亡蛋白Bcl-2表達減弱相關。

[關鍵詞] 消痰散結方；結腸癌干細胞樣細胞；凋亡；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate effect of Xiaotan Sanjie Recipe on apoptosis of colon cancer stem-like cells （CCSCs） and its related mechanism. Methods The CCSCs were induced from colon cancer cell line HCTl16 in serum-free medium. The expressions of CD44 were detected to identify CCSCs. The lyophilized powder of Xiaotan Sanjie Recipe Extract was dissolved in cell culture fluid， so as to make preserving fluid of Xiaotan Sanjie Recipe. CCSCs were treated with different concentrations of Xiaotan Sanjie Recipe （0.125， 0.25， 0.5， 1.0 mg/mL） for 72 h. The effects of different concentrations of Xiaotan Sanjie Recipe for CCSCs were detected by Annexin-V/PI staining combined with flow cytometry. The expression changes of Bax， Bcl-2 protein after drug intervention were detected by Western blot. Results HCT116 cells formed cancer stem cell spheres in serum-free medium. The proportion of CD44 cells in cell spheres was （49.69±1.89）%. Xiaotan Sanjie Recipe could induce the cell apoptosis， the apoptosis rate was statistically significant different compared with the control group （0 mg/mL） （P < 0.05）， the apoptotic effects showed concentration-dependent. After application of Xiaotan Sanjie Recipe， the expression of pro-apoptotic protein Bax of Bcl-2 family was increased， meanwhile the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was decreased. The effect was more pronounced in 0.5 mg/mL and 1.0 mg/mL concentration groups. Conclusion CCSCs are successfully induced from HCT116 colon cancer cell line. Xiaotan Sanjie Recipe can induce CCSCs in a dose-dependent manner， the mechanism may be related to the increased expression of pro-apoptotic protein Bax and decreased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2.

[Key words] Xiaotan Sanjie Recipe； Colon cancer stem-like cells； Apoptosis； Bax protein； Bcl-2 protein

結直腸癌每年有120萬新發病例和60萬死亡病例[1]。我國晚期結直腸癌即使行根治性切除后5年生存率為40%～50%[2]。結腸癌干細胞突變于正常的結腸隱窩干細胞[3]，具有自我更新、高度增殖潛能[4]、高致瘤性[5]、強耐藥性[6]及多向分化的特點，因此有效殺傷腫瘤干細胞的藥物及靶點，成為腫瘤研究中的一個重要方向。中藥復方消痰散結方是著名腫瘤專家魏品康教授的臨床驗方，臨床及基礎實驗證實療效明確[7-8]。本研究將腫瘤干細胞研究與中藥復方消痰散結方結腸癌研究相結合，旨在進一步探索消痰散結方是否能成為清除腫瘤干細胞的靶向藥物。endprint

1 材料與方法

1.1 細胞株

HCT116人結直腸癌細胞株，購自中國科學院上海生科院細胞庫。培養條件37℃、5%CO2；培養基為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 pg/mL鏈霉素的McCoy′s 5A培養基；用含0.01% EDTA的0.25%胰酶進行消化傳代，細胞處于對數生長期后用于實驗。

1.2 藥物

消痰散結方由天南星、法半夏、全蝎、蜈蚣、雞內金、茯苓、山慈菇、蚤休、枳實、陳皮、白芥子、炙甘草12味中藥組成，中藥飲片購自上海雷允上公司，第二軍醫大學附屬長征醫院制劑室水蒸醇提法制備浸膏，原藥材濃度為3.35 g/mL。消痰散結方凍干粉末保存液制備[9]：將消痰散結方浸膏在超凈水中稀釋5倍，16 000 r/min，離心半徑20 cm，離心10 min，取上清液，-80℃制備凍干粉末，稱重，溶解在細胞培養液中制備保存液，0.22 μm膜過濾，保存液藥物濃度為10 mg/mL（原藥材濃度為0.22 g/mL）。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（奧地利PAA Laboratories GmbH公司）；McCoy′s 5A培養基、Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium（DMEM）/F12培養基；B27supplement（均為美國GIBCO公司）；表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國PeproTech公司）。鼠抗人GAPDH一抗（美國Proteintech，貨號60004-1-Ig），兔抗人Bcl-2一抗（美國SAB，貨號#35342）、兔抗人Bax一抗（美國SAB，貨號#34260），Annexin-V/FITC細胞凋亡試劑盒（美國BD公司，Cat No.556547）。CO2細胞培養箱（美國Forma Scientific公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司，TS100）；Model Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統；流式細胞儀（美國BD公司，EPICS-XL型）。

1.4 HCT116結腸癌干細胞培養及鑒定

取HCT116細胞接種于含20 μL/L EGF及20 μL/L bFGF的無菌無血清DMEM/F12培養基（serum free medium，SFM）中，最終細胞數為4×103/mL，37℃、5%CO2培養箱中培養。分別于培養第3、5、7天在倒置顯微鏡下觀察和拍攝，待細胞完全貼壁形態改變時，停止培養。將PE標記的CD44抗體加入細胞懸液中，流式細胞儀檢測CD44表達情況。

1.5 細胞分組與干預方法

各實驗組加入消痰散結方保存液，使藥物終濃度為0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL，37℃、5%CO2培養箱中藥物作用72 h。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 Annexin-V/PI雙染色結合流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集細胞培養液，加入500 μL 0.25%胰酶（不含EDTA），37℃、5%CO2培養箱中消化3～5 min，中止消化反應移至流式管中，1500 r/min×5 min離心，按9∶1的比例用PBS稀釋試劑盒中緩沖液（10×），沉淀細胞內加入緩沖液（1×），檢測管中加入試劑盒中FITC Annexin-V 3.8 μL，室溫反應10 min，加入試劑盒中碘化丙啶3.8 μL，加入120 μL緩沖液（1×）。檢測細胞凋亡，以FITC熒光信號讀數為橫坐標，PI熒光信號讀數為縱坐標。

1.6.2 Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白（Bax、Bcl-2） 細胞裂解后按產品說明用BCA法測定蛋白濃度，等量的蛋白樣品（40 μg）經10% SDS-PAGE電泳分離后，轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，GAPDH一抗按1∶5000稀釋，Bax、Bcl-2一抗按1∶1000稀釋，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次后，加入1∶2000稀釋的HRP標記的羊抗鼠或羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST再次洗滌3次，加入ECL發光底物，在WB凝膠成像系統中成像、攝圖。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，Levene法檢驗方差齊性，多組均數間比較采用單因素方差分析，各實驗組與對照組比較采用Dunnett-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCT116結腸癌干細胞富集培養及鑒定

置于SFM培養后，HCT116細胞呈卵圓形，且聚集成球，于培養液中懸浮生長。同時經流式細胞儀檢測結腸癌干細胞樣細胞（CCSCs）表面標志物CD44表達情況，發現CD44+占（49.69±1.89）%，成功富集了CCSCs。見圖1～2。

2.2 消痰散結方誘導結腸癌干細胞凋亡

消痰散結方作用于CCSCs 72 h的IC50是0.25 mg/mL，故取以下4個濃度：0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL，作用CCSCs 72 h后，Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡。結果顯示，從0.125 mg/mL濃度起，消痰散結方即誘導CCSCs凋亡，其凋亡率與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；隨著藥物作用濃度增高，細胞凋亡率也逐漸增高（P < 0.01），效應呈濃度依賴型。見圖3～4。

2.3 消痰散結方對結腸癌干細胞凋亡相關蛋白表達的影響

消痰散結方作用于CCSCs 72 h，WB檢測細胞凋亡相關蛋白的表達。結果顯示，消痰散結方作用后，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax表達增強，抑凋亡蛋白Bcl-2表達減弱，以0.5 mg/mL及1.0 mg/mL濃度組更為顯著。見圖5。endprint

3 討論

結腸癌屬中醫學的“腸積”“鎖肛痔”等病的范疇。筆者所在學科為國家中西醫結合重點學科，長期致力于中西醫結合防治消化道腫瘤，總結臨床實踐發現：發生腸癌的三大外因（外感濕熱、飲食不節、情志所傷），其本質皆可歸結于“痰”。第一，外感濕熱，導致水濕困脾，脾失健運，則濕聚為痰，內外之痰濕日久不去，發為腸癌。第二，現代人多食膏粱厚味，日久損傷脾胃，滋生痰濕，痰濕不去化熱，下迫大腸，與腸中之糟粕交阻搏擊，日久成塊。第三，情志所傷所愿不遂，肝氣郁結，肝木太過克伐脾土，脾失健運，水濕內生，郁而化熱，痰熱合邪，下迫大腸，誘生腸癌[10-11]。基于此，我們制訂消痰散結法為治療腸癌侵襲轉移的主要法則，消痰散結方為其代表方，方以法半夏、天南星辛溫苦燥，善消痰燥濕共為君，蜈蚣、全蝎等解毒散結通絡共為臣，陳皮理氣和胃、雞內金助胃之消導而為佐，炙甘草溫中健脾，調和諸藥為使，運用于臨床實踐證實，消痰散結法是治療晚期腸癌的有效方法之一[7-8]。筆者前期研究發現，消痰散結方可顯著抑制腸癌HCT116親代細胞增殖，促進凋亡，并且阻滯其細胞周期[12-13]。

腸癌干細胞突變于正常的結腸隱窩干細胞，故其具有干細胞和腫瘤細胞的雙重特性，被認為具有腫瘤發生能力的腫瘤細胞亞群[5]。無血清培養基培養法為目前常用的分離腫瘤干細胞的體外研究方法，來源于用“干細胞培養基”篩選神經干細胞的方法，原理是良性腫瘤細胞和已分化癌細胞在“無血清超低黏附”培養條件下，會因為缺乏營養物質和失巢凋亡而死亡，只有未分化癌細胞能夠在其中存活、增殖，形成懸浮集群并最終形成球體[14]。它既是體外CCSCs的識別方法，又是CCSCs的富集方法[15]，本實驗培養分選HCT116細胞的腸癌干細胞，并通過流式檢測腫瘤干細胞表面標志物CD44，進行驗證。有實驗證實，采用Ad-CD44-shRNA方法敲低HCT-116細胞的CD44表達后，發現細胞增殖、遷移和侵襲顯著減少，細胞凋亡增加[16]。實驗進一步采用消痰散結方凍干粉溶解液作用于腸癌干細胞，觀察到消痰散結方對腸癌干細胞有促凋亡作用，并且凋亡率隨作用濃度升高而增加。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，細胞凋亡信號調控異常、引起細胞過度積累是導致癌癥發生的機制之一[17]。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡信號轉導中發揮重要作用[18]，據功能不同Bcl-2家族分為促凋亡蛋白（如Bax）和抑凋亡蛋白（如Bcl-2），基礎研究顯示，Bax、Bcl-2對腫瘤干細胞增殖有明確的作用[19-20]。消痰散結方體外作用腸癌干細胞后，促凋亡蛋白Bax表達增強，抑凋亡蛋白Bcl-2表達減弱，并呈濃度依賴性，消痰散結方誘導結腸癌干細胞凋亡的機制與對Bcl-2蛋白家族的調控相關。

綜上所述，本研究提示從HCT116結腸癌細胞成功誘導培養出CCSCs，消痰散結方能劑量依賴性地誘導CCSCs凋亡，其機制可能與促凋亡蛋白Bax表達增強、抑凋亡蛋白Bcl-2表達減弱相關，為闡明消痰散結方抗結腸癌的分子靶點提供了一定依據。

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（收稿日期：2017-05-19 本文編輯：張瑜杰）endprint