曲古抑菌素A對抑郁模型大鼠行為及腦源性神經營養因子表達的作用研究

李昆+孫國平+盧豪忠

[摘要] 目的 探討曲古抑菌素A對慢性不可預見性應激（CUMS）模型大鼠抑郁樣行為及腦源性神經營養因子（BDNF）表達的調節作用。 方法 將40只成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、氟西汀組和曲古抑菌素A組。采用不同應激因子交替刺激加孤養復制CUMS模型；采用體重增長率、糖水偏嗜試驗和曠場試驗評估大鼠的行為學變化；采用Western blot測定大鼠海馬組織中BDNF和磷酸化環磷腺苷反應元件結合蛋白（p-CREB）的表達水平。 結果 造模21 d后，模型組大鼠體重增長率、糖水偏嗜度、水平和垂直運動評分較正常對照組顯著降低（P < 0.05）；氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠體重增長率、糖水偏嗜度、垂直和水平運動評分均較模型組顯著增加（P < 0.05）。Western blot結果顯示，模型組大鼠海馬區BDNF和p-CREB表達水平顯著低于正常對照組（P < 0.05），而氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬區BDNF和p-CREB表達水平顯著高于模型組（P < 0.05）。 結論 曲古抑菌素A可有效改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，其抗抑郁作用可能與調節CREB-BDNF通路促進BDNF表達有關。

[關鍵詞] 抑郁癥；曲古抑菌素A；氟西?。荒X源性神經營養因子；環磷腺苷反應元件結合蛋白

[中圖分類號] R749.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Trichostatin A on behaviors and expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in model rats with chronic unpredictable mild stress-induced depression （CUMS）. Methods Forty adult male SD rats were randomly divided into normal control group， model group， Fluoxetine group and Trichostatin A group. The model of depression was established with alternative unpredictable stress combining isolated living conditions. The rat ethological changes were assessed by body weight， sucrose consumption and open field test. The protein expressions of BDNF and phosphorylated cAMP responsive element binding protein （p-CREB） were measured by Western blot. Results After modeling for 21 days， the body weight， sucrose consumption， horizontal motion and vertical motion scores in model group were significantly lower than those of normal control group （P < 0.05）； however， these ethological indexes in Fluoxetine group and Trichostatin A group were obviously increased compared with those of model group （P < 0.05）. The results of Western blot showed that the expression of BDNF and p-CREB in model group were significantly lower than those of normal control group （P < 0.05）， while the expression of BDNF and p-CREB in Fluoxetine group and Trichostatin A group were significantly higher than those of model group （P < 0.05）. Conclusion Trichostatin A can effectively improve depression-like behaviors in CUMS model rats， its anti-depressive effect may be attributed to up-regulation of the CREB-BDNF signaling pathway.

[Key words] Depression； Trichostatin A； Fluoxetine； Brain-derived neurotrophic factor； cAMP response element-binding protein

抑郁癥是一種心境障礙性精神疾病，其病因和發病機制復雜，且發病率逐年升高，嚴重影響人類的精神健康和生存質量[1]。表觀遺傳學的研究為闡明抑郁癥的發病機制和尋求新的治療靶點提供了新的方向。組蛋白的乙酰化修飾是表觀遺傳學的重要組成部分，既往研究證實由組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）介導的組蛋白修飾在抑郁癥的發生、發展過程中發揮重要作用[2]。HDAC6是HDACs ⅡB類成員，研究表明HDAC6在海馬神經突觸結構和功能可塑性方面起著重要的調控作用，并且抑制HDAC6活性可顯著改善小鼠的抑郁樣行為，這表明HDAC6有望成為治療抑郁癥的潛在藥物靶點[3-4]。進一步研究顯示，HDAC6調控神經突觸重塑可能與調控轉錄因子環磷腺苷反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的磷酸化水平及腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達相關[5-7]。曲古抑菌素A是HDAC6的一種小分子選擇性抑制劑，其在抑郁癥中的藥理作用研究鮮有報道。本研究以慢性不可預見性應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠為研究對象，通過觀察其行為學的改變以及腦內相關蛋白的表達，對曲古抑菌素A的抗抑郁作用及其對海馬CREB-BDNF信號轉導通路的影響進行初步探討。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重180～200 g，7～9周齡，由上海交通大學醫學院實驗動物中心提供（合格證號：中科動管第003號），自由進食飲水，實驗前適應性飼養1周。1周后進行曠場實驗評分，選取評分相近的大鼠40只，按隨機數字表法將其分為四組：正常對照組、模型組、氟西汀組和曲古抑菌素A組，每組10只。

1.2 藥物與試劑

曲古抑菌素A和鹽酸氟西汀購自Sigma公司；磷酸化環磷腺苷反應元件結合蛋白（p-CREB）抗體、BDNF抗體和β-actin抗體購于Abcam公司；其他Western blot相關試劑均購自中國碧云天生物科技有限公司。

1.3 造模與給藥

正常對照組每籠5只飼養，正常飲水進食，不給予任何刺激。其余各組采用CUMS結合孤養方法建立大鼠抑郁模型[8]。CUMS包含以下7種不同的刺激因子：①禁食24 h；②禁水24 h；③高速水平震蕩5 min；④晝夜顛倒；⑤4℃冷刺激5 min；⑥45℃熱刺激5 min；⑦夾尾5 min。每日隨機給予一種應激刺激，相同刺激不連續出現，應激前10 min按分組（正常對照組：3 mL生理鹽水；模型組：造模刺激+3 mL生理鹽水；氟西汀組：10 mg/kg氟西汀；曲古抑菌素A組：25 mg/kg曲古抑菌素A）腹腔注射（ip）給藥，連續21 d。

1.4 行為學評估

①體重增長率的測定：在實驗第l天和第21天分別稱取各組大鼠體重，計算體重增長率：體重增長率=（第21天體重-第1天體重）/第1天體重。②糖水偏嗜實驗：在實驗21 d后，當晚20：30禁水，第2天早上8：30給予每只大鼠等量的1%蔗糖水和純水，測定每只大鼠1 h內蔗糖水和純水消耗量，計算糖水偏嗜度：糖水偏嗜度=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。③曠場實驗：將大鼠放入100 cm×100 cm×60 cm的四壁黑色、底壁白色的無蓋方箱內，底面由面積相等的100個方格組成。以大鼠穿越底面格子數為水平運動得分（每格計1分），直立次數為垂直運動得分（雙足離開底面并放下雙足計1分）。每只動物測定1次，每次5 min。

1.5 Western blot法測定海馬組織中p-CREB和BDNF的表達

將大鼠斷頭處死后，于冰板上迅速分離兩側海馬，超聲勻漿后離心2次取上清液，BCA法進行蛋白濃度定量。10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，冰浴下轉膜。室溫封閉1 h后，加入一抗（p-CREB、BDNF和β-actin），稀釋比例均為1∶1000，4℃下孵育過夜。洗膜，用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL顯影劑曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值作為蛋白表達水平的定量指標。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件（La Jolla，CA）進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠體重增長率的影響

實驗結果顯示，21 d后模型組大鼠的體重增長率較正常對照組顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；氟西汀組和曲古抑菌素A組的大鼠體重增長率較模型組顯著增加，差異有統計學意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組的大鼠體重增長率與氟西汀組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠糖水偏嗜度的影響

實驗結果顯示，與正常對照組糖水偏嗜度比較，模型組大鼠糖水偏嗜度明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠的糖水偏嗜度均明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠的糖水偏嗜度比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 曲古抑菌素A對 CUMS 抑郁模型大鼠曠場行為的影響

實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠水平運動和垂直運動得分均顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組水平運動和垂直運動得分均明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠水平運動和垂直運動得分比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠海馬p-CREB表達的影響

實驗結果顯示，模型組海馬p-CREB表達較正常對照組顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬組織中p-CREB表達明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠海馬組織中p-CREB表達水平比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4。

2.5 曲古抑菌素A對CUMS抑郁模型大鼠海馬BDNF表達的影響

為了進一步探究曲古抑菌素A對CUMS模型大鼠海馬BDNF表達的影響，本研究采用Western blot檢測了大鼠海馬組織中BDNF的表達水平。結果顯示：與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織中BDNF的表達顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；與模型組比較，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬組織中BDNF表達明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；曲古抑菌素A組和氟西汀組大鼠海馬組織中BDNF表達水平比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖5。endprint

3 討論

表觀遺傳學是指在核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達發生可遺傳的變化。研究表明包括組蛋白乙?；?、DNA甲基化、miRNA及lncRNA調控在內的表觀遺傳學修飾在抑郁癥中起著重要作用[9-10]。與核苷酸序列改變引起的疾病不同，表觀遺傳變異可通過相關藥物予以逆轉，因此，對表觀遺傳修飾進行深入研究在抑郁癥的治療中具有重要意義。既往研究表明，HDACs廣泛性抑制劑如丙戊酸鹽、丁酸鹽及環庚烷異羥肟酸（SAHA）等可顯著改善抑郁動物模型的抑郁樣行為[11-14]。進一步研究發現，HDACⅡB類中的HDAC6在海馬神經突觸結構和功能可塑性方面起著重要的調控作用，并且特異性抑制HDAC6活性可顯著改善小鼠的抑郁樣行為。因此，研究和開發HDAC6抑制劑對于抗抑郁藥物開發具有重要的研究意義[3-4]。本研究采用CUMS抑郁模型大鼠為研究對象，以臨床一線抗抑郁藥物氟西汀作為陽性對照，考察了HDAC6選擇性抑制劑曲古抑菌素A對大鼠抑郁樣行為的影響。實驗結果表明，經過21 d的CUMS抑郁造模，模型組大鼠體重增長率和糖水消耗率降低，曠場試驗中運動能力下降（P < 0.05）；而給予曲古抑菌素A治療的大鼠體重增長率、糖水消耗率以及曠場試驗中的運動能力較模型組比較顯著改善（P < 0.05），且曲古抑菌素A在實驗濃度下抗抑郁效果與氟西汀比較差異無統計學意義。這提示，曲古抑菌素A可顯著改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，具有顯著的抗抑郁作用。

CREB是一種核轉錄因子，CREB的轉錄調節功能受自身磷酸化的調節[15]。CREB在細胞核內以去磷酸化狀態存在時沒有轉錄活性，當細胞內環磷酸腺苷（cAMP）濃度升高激活蛋白激酶A（PKA）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等后可使CREB磷酸化為有轉錄調節活性的p-CREB[16]。cAMP-CREB通路與抑郁癥密切相關，研究表明抑郁模型動物海馬cAMP-CREB通路下調，抗抑郁治療后可顯著提高其海馬區cAMP及p-CREB的蛋白表達[17]。表觀遺傳學的研究表明HDAC6可通過調控CREB影響神經突觸重塑，這表明曲古抑菌素A的抗抑郁機制可能與調控CREB的磷酸化水平相關[6]。本研究采用Western blot檢測了各組大鼠海馬p-CREB的表達水平，結果顯示應激抑郁大鼠海馬組織中p-CREB表達下調，而曲古抑菌素A能顯著逆轉抑郁模型大鼠海馬p-CREB的表達下調。

BDNF是cAMP-CREB通路介導抗抑郁治療的重要靶標，BDNF因其在神經元結構和功能可塑性調節中的重要作用，被認為是抑郁癥發生的多通路調節的交匯點，同時也是抗抑郁治療的重要靶點之一[18-19]。研究發現抑郁癥患者血清BDNF水平較正常人群顯著下降，抗抑郁治療可明顯提高其血清BDNF水平[20]。動物實驗表明，抑郁模型動物海馬組織中的BDNF表達水平會發生顯著下調，給予抗抑郁藥物治療后可明顯提高海馬組織中的BDNF表達水平[21-22]。為了探究曲古抑菌素A對海馬BDNF表達的調控作用，本研究采用Western blot檢測了實驗各組大鼠海馬區的BDNF表達水平。結果顯示，模型組大鼠海馬BDNF表達水平較正常對照組明顯下調，氟西汀組和曲古抑菌素A組大鼠海馬組織中BDNF表達較模型組明顯升高，而氟西汀組和曲古抑菌素A組的BDNF表達水平差異無統計學意義。這提示曲古抑菌素A的抗抑郁樣作用可能是通過增加CREB的磷酸化促進BDNF表達而實現的。

綜上所述，本研究提示曲古抑菌素A能夠顯著改善CUMS 模型大鼠的抑郁樣行為，進一步研究發現，曲古抑菌素A可能是通過調控CREB-BDNF通路而發揮上述抗抑郁樣作用，在一定程度上為抗抑郁癥新藥物的開發提供了相關實驗和理論依據，但其具體作用機制仍有待進一步研究。

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（收稿日期：2017-04-26 本文編輯：張瑜杰）endprint