正交設(shè)計優(yōu)化擬缺香茶菜總黃酮提取工藝△

陳慧平，李曉寧，羅含希，鄒敏

(1.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院，河南 鄭州 450052;2.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

·中藥工業(yè)·

正交設(shè)計優(yōu)化擬缺香茶菜總黃酮提取工藝△

陳慧平1*，李曉寧2，羅含希1，鄒敏1

(1.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院，河南 鄭州 450052;2.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

目的：優(yōu)化擬缺香茶菜總黃酮提取工藝。方法：采用 L9(34)正交試驗，以擬缺香茶菜總黃酮的含量為綜合指標，采取加熱回流方法，考察提取溫度(A)、液料比(B)、提取時間(C)、乙醇濃度(D)4個因素對提取效果的影響。結(jié)果：最佳提取工藝為溫度90 ℃、液料比40∶1、提取2.0 h、60%乙醇，平均得率為5.668 6%。結(jié)論：該工藝簡便合理，穩(wěn)定可行，可為擬缺香茶菜總黃酮提取工藝的確定提供依據(jù)。

擬缺香茶菜；總黃酮；正交試驗；提取工藝

擬缺香茶菜別名野紫蘇，為唇形科香茶菜屬植物的干燥地上部分，治療慢性咽炎及食管癌療效確切[1]。在我國分布范圍相當廣泛，是民間廣泛使用的草藥，具有清熱解毒、活血化瘀、抗菌消炎及抗腫瘤等功能[2]。根據(jù)系統(tǒng)預實驗可知，擬缺香茶菜的化學成分主要含有二萜、三萜、黃酮等活性成分，其中黃酮含量比較高。黃酮類物質(zhì)是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物，具有抑菌、降壓、保肝、美白、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗輻射等多種藥理作用[3]。目前未見有關(guān)擬缺香茶菜總黃酮含量測定及提取工藝研究的報道。本實驗采用回流熱浸法進行正交試驗設(shè)計，探究擬缺香茶菜總黃酮含量的最佳提取工藝，以期待為擬缺香茶菜的質(zhì)量控制及其總黃酮的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

lambda 35紫外可見分光光度計(perkin elmer)；AR1530型電子天平(梅特勒-托利多有限公司)；DFY-400搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械)。

1.2 試劑與藥材

植物藥擬缺香茶菜采自河南龍浴灣，經(jīng)鄭州大學藥學院李繼成教授鑒定為唇形科擬缺香茶菜。將采集的擬缺香茶菜地上部分自然陰干，磨碎，裝入塑料袋密封，置于干燥陰涼處備用。蘆丁對照品(批號：ld150822-17，Stanford analytical chemicals inc.)；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 擬缺香茶菜總黃酮含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取擬缺香茶菜藥材粉末2.000 g，加入一定的乙醇和水混合溶液于加熱套中加熱回流提取，過濾，濾渣再加一定量乙醇和水混合溶液回流，回流提取3次，合并濾液轉(zhuǎn)至200 mL容量瓶中，加相應(yīng)的水和乙醇至刻度定容，搖均，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取在120 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品0.012 26 g 置50 mL容量瓶中，加70%乙醇適量，水浴加熱，完全溶解，放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(含無水蘆丁0.245 2 mg·mL-1)。

2.1.3 測量波長的選擇 吸取對照品溶液和供試品溶液各1.0 mL置25 mL的容量瓶中，先加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，6 min后，加入10%的硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，6 min后，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，加水稀釋至刻度，搖勻后，靜置15 min，置紫外分光光度計lambda 35進行全波長掃描，得出在357 nm處有最大特征吸收峰，因此將357 nm定為最大吸收波長。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL分別置于標號為0、1、2、3 、4、5的25 mL容量瓶中，按2.1.3項下操作。以試劑為空白參比液，將所有的待測溶液置紫外分光光度計lambda 35，在357 nm處測吸光度值，以蘆丁濃度(X)作為橫坐標，以吸光度值(Y)作為縱坐標，作圖，回歸處理后得標準曲線方程：Y=42.466X-0.138 02，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。結(jié)果表明，蘆丁對照品在0.00～0.015 mg·mL-1與吸光度值呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 取蘆丁對照品6份，按2.1.3項下方法顯色測定，結(jié)果RSD為0.16%，表明精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取適宜濃度的蘆丁對照品溶液1.0 mL置25 mL容量瓶中，按2.1.3項下操作。以試劑為空白參比液，置紫外分光光度計lambda 35，在357 nm處測得吸光度值，以顯色15 min后的時刻設(shè)為0時刻，在0、15、30、45、60、90、120 min測其吸光度，得出結(jié)果RSD為0.18%，說明蘆丁的顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性良好，樣品溶液應(yīng)在顯色后2 h內(nèi)完成含量測定。

2.2 橘葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

根據(jù)預實驗結(jié)果，影響擬缺香茶菜中總黃酮提取效率的因素主要有乙醇濃度、提取時間、液料比和提取溫度，正交試驗設(shè)計中每個因素選擇3個水平值，因素水平值通過單因素考察來確定。

2.2.1 單因素考察

2.2.1.1 提取時間的考察 取樣品粉末5份，每份2.000 g，精密稱定，加入60%乙醇40 mL，溫度為80 ℃，分別加熱回流提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，趁熱過濾，共提取3次，合并3次濾液，用60%乙醇定容至200 mL，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖1。

圖1 提取時間考察折線圖

由圖1可知，提取1.5 h能達到較好的效果，所以選取提取時間考察的水平值為1.0、1.5、2.0 h。

2.2.1.2 乙醇濃度的考察 取樣品粉末5份，每份2.000 g，精密稱定，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇40 mL，80 ℃加熱提取1.5 h，趁熱過濾，濾液另器保存，共提取3次，合并3次濾液，用對應(yīng)濃度的乙醇定容至200 mL，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度考察折線圖

由圖2可知，60%乙醇具有較好的提取效果，所以確定乙醇濃度考察的水平值為50%、60%和70%。

2.2.1.3 液料比考察 取樣品粉末5份，每份2.000 g，精密稱定，分別加入60%乙醇40、60、80、100、120 mL，80 ℃加熱提取1.5 h，趁熱過濾，濾液另器保存，提取3次，合并3次濾液，用對應(yīng)濃度的乙醇定容至500 mL，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖3。

圖3 液料比考察折線圖

由圖3可知，液料比40∶1具有較好的提取效果，所以確定液料比考察的水平值為30∶1、40∶1和50∶1。

2.2.1.4 提取溫度考察 取樣品粉末5份，每份2.000 g，精密稱定，分別加入60%乙醇80 mL，加熱提取1.5 h，分別在60、70、80、90、100 ℃下水浴加熱提取，冷卻至室溫過濾，濾液另器保存，分別提取3次，合并3次濾液，用60%乙醇定容至250 mL，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度考察折線圖

由圖4可知，溫度80 ℃具有較好的提取效果，所以確定提取溫度考察的水平值為70、80、90 ℃。

2.2.2 正交試驗 采用L9(34)正交試驗表安排試驗，并按2.1中方法，按各工藝提取條件對總黃酮量進行考察，具體因素水平和實驗結(jié)果及對結(jié)果的方差分析，見表1～3。

因素及水平：考察溫度(A)、提取時間(B)、液料比(C)、乙醇濃度(D)四個因素三水平進行正交試驗，優(yōu)選擬缺香茶菜黃酮的最佳提取工藝，以擬缺香茶菜總黃酮的含量為考察指標，選用L9(34)正交表進行試驗，因素水平見表1。

由表2和表3可知，4個因素對總黃酮提取率的影響從大到小依次是：乙醇濃度>液料比>溫度>提取時間。且由表3方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度和液料比對提取率有顯著性影響，提取時間和次數(shù)、溫度對提取率沒有顯著性影響。由直觀分析可知，總黃酮提取率最高的工藝應(yīng)為A3B3C3D1，即用50%乙醇提取，液料比為50∶1，提取時間為2 h，提取溫度90 ℃。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

注：A.提取溫度；B.提取時間；C.液料比；D.乙醇濃度。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.3 驗證試驗 精密稱取擬缺香茶菜藥材粗粉2.000 g，按最佳提取工藝條件A3B3C3D1平行操作，測定吸光度并計算黃酮含量，結(jié)果見表4。

表4 工藝驗證試驗 %

3 討論

黃酮類化合物已被證明具有抗肝臟毒性、抗炎、抗菌、抗病毒、解痙、清除自由基、降血壓、軟化血管等生理活性。近年的研究發(fā)現(xiàn)，某些黃酮類化合物具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性，且對正常細胞毒性較小[4]。

根據(jù)“相似相溶”原則，黃酮類物質(zhì)屬于中等級性物質(zhì)，易溶于中等或中等偏極性的溶劑中。乙醇水溶液由于引入了羥基，乙醇分子之間不但彼此以氫結(jié)合，而且和水分子也形成氫鍵，降低了水的極性，故黃酮類物質(zhì)的溶解度增加。本工藝充分考慮到總黃酮和多糖溶解性的差異，在總黃酮提取過程中選擇最適體積分數(shù)的乙醇作為溶劑，除了能最大限度地提取總黃酮外，還能盡量減少多糖的溶出，使測定結(jié)果更準確[5]。

總黃酮含量測定研究中，穩(wěn)定性考察時隨著時間的延長供試溶液的吸光度呈下降趨勢，雖然在120 min內(nèi)，數(shù)值變化RSD值僅為0.18%，較穩(wěn)定，但最好能在顯色后60 min內(nèi)完成測定工作，以減小測量誤差。

本實驗優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行性較高，適用于擬缺香茶菜總黃酮的提取。綜上所述，采用正交設(shè)計優(yōu)化擬缺香茶菜總黃酮的提取工藝，能優(yōu)選最佳工藝提取擬缺香茶菜中的總黃酮，為擬缺香茶菜的深入研究和開發(fā)利用提供實驗依據(jù)，也有利于擬缺香茶菜藥材的優(yōu)劣鑒別，此外，本實驗結(jié)果顯示，擬缺香茶菜藥材總黃酮含量較高，具有很好的開發(fā)潛力。

[1] 李火云，焦珂，張鵬，等.擬缺香茶菜化學成分研究[J].中草藥，2014，45(2)：154-160.

[2] 陳慧平，馬方，鄒敏，等.擬缺香茶菜提取物體外對3種腫瘤細胞增殖的抑制作用[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版)，2015，50(5)：624-626.

[3] 陳文龍，陳燕芬，盧傳堅，等.土茯苓總黃酮提取工藝的正交設(shè)計優(yōu)化[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25(3)：544-546.

[4] 張志東，林少珠，吳曉松.正交試驗優(yōu)化桑寄生黃酮的提取工藝[J].中藥材，2012，35(5)：810-812.

[5] 付亮，袁璟亞，楊瑞武，等.正交試驗優(yōu)化淫羊藿總黃酮和多糖的分步提取工藝優(yōu)化[J].食品科學，2012，33(24)：56-60.

OptimizationoftheExtractionTechnologyofTotalFlavonoidsfromIsodonexcisoidesbyOrthogonalExperiment

CHENHuiping1*，LIXiaoning2，LUOHanxi1，ZouMin1

(1.AcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China； 2.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：The optimal conditions of total flavonoids fromIsodonexcisoideswere investigated by orthogonal array design.Methods：The content of total flavonoids was determined spectrometrically using rutin as the reference substance.The effects of extraction temperature，extraction time，liquid/material ratio，ethanol concentration on the content of total flavonoids in extracts were investigated by one-factor-at-a-time method，and the extraction conditions were optimized by orthogonal array design.Results：Ethanol concentration and liquid/material ratio were the key factors that affected the extraction of total flavonoids.The optimal extractive conditions were obtained as follows：temperature 90 ℃，treatment time 120 min，liquid/material ratio 50∶1 and ethanol concentration 50%.Under these conditions，the extraction yield of total flavonoids fromI.excisoideswas 5.668 6%.Conclusion：The optimized process remarkably increases the extraction yield of total flavonoids fromI.excisoidesand has a promising prospect for practical applications.

Isodonexcisoides；total flavonoids；orthogonal array design；extraction

河南省自然科學基金(152300410159)；河南省高等學校重點科研項目(16A350011)

] 陳慧平，助理研究員，研究方向：天然藥化及藥理；Email：baihe7879@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.021

2016-10-12)

*[