雙向電泳技術篩選鑒定冬蟲夏草中指標性蛋白質研究△

童芯鋅，王藝璇，陳璐，邱乙，萬德光，任艷，彭成，沈才洪，李軍德，國錦琳,*

(1.成都中醫藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137；2.瀘州老窖博士后工作站，四川 瀘州 646000；3.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

·專題·

雙向電泳技術篩選鑒定冬蟲夏草中指標性蛋白質研究△

童芯鋅1，王藝璇1，陳璐1，邱乙1，萬德光1，任艷1，彭成1，沈才洪2，李軍德3，國錦琳1,2*

(1.成都中醫藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都611137；2.瀘州老窖博士后工作站，四川 瀘州646000；3.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京100700)

對名貴中藥材冬蟲夏草及其偽品建立穩定可靠的雙向電泳鑒定方法。正品冬蟲夏草中共同表達的蛋白質斑點為88個，偽品穩定差異表達的蛋白質斑點為21個，提示可作為下一步冬蟲夏草鑒定的指標性組分。進一步質譜分析與NCBI數據庫比對表明：6種蛋白僅來自于菌數據庫，9種蛋白僅來自于昆蟲數據庫，12種蛋白僅來自于全庫，3種蛋白昆蟲和菌的數據庫均能檢索，1種蛋白僅來自于菌數據庫和全庫，提示下一步可進行冬蟲夏草指標性蛋白質功能研究，為冬蟲夏草有效成分研究奠定基礎。

冬蟲夏草；雙向電泳；指標性蛋白質；功能蛋白質

冬蟲夏草為麥角菌科冬蟲夏草菌Ophiocordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的幼蟲尸體及子座的復合體[1]，屬國家二級保護名貴藥材。由于其野生資源分布區域狹窄，目前尚無成熟人工培植技術，藥材需求量大，市場供求嚴重失衡。加之全球變暖、雪線上移，蝙蝠蛾大量死亡，產量逐年減少，資源缺乏，故極為珍貴[2-3]。全世界已報道的蟲草屬真菌有400多種，我國有60多種，可寄生于9個目昆蟲的幼蟲、蛹和成蟲，但中華人民共和國藥典收載的冬蟲夏草其寄主是產于我國青藏高原特殊高寒生境的蝠蛾幼蟲，因而市場摻偽、摻假現象時有發生[4-5]，嚴重影響了市場流通和臨床安全[6]。目前，鑒別冬蟲夏草及其混偽品多采用外觀、顯微、理化等方法與技術，由于冬蟲夏草品種繁多，種間相似度較高，憑借外觀或經驗不能很好地進行鑒別。尤其是將其加工成粉末產品，常規鑒定方法基本不能有效鑒定，因此，亟需建立一種全新而可靠的冬蟲夏草鑒定方法[7-8]。

冬蟲夏草含量最高的一類化學成分即為蛋白質，約25%～32%。作為初級代謝產物的蛋白質(肽)，在物種體內具有穩定的含量和物種特異性，可以作為物種鑒定的有效依據，目前在中藥材鑒定中未能受到重視[9-14]。雙向電泳技術可將數千種蛋白質同時分離，且重現性高。本研究首次應用蛋白組學技術尋找到正品冬蟲夏草中的特異性蛋白質(多肽)，作為冬蟲夏草的指標性組分，開拓了新的鑒定思路，為后續動物藥材和果實種子類藥材的鑒定進行了有益的探索。

1 材料

1.1藥材

藥材均為實驗室采集或收集，經國錦琳教授鑒定后留樣成都中醫藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室。

表1 蟲草類藥材信息表

表1(續)

1.2試劑

丙烯酰胺、N，N′-甲叉丙烯酰胺、Tris堿、甘氨酸、碘乙酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、過硫酸銨、BSA均為Sigma產品；IPG膠條(17cm，pH3～10)、兩性電解質(Bio-lyte，pH3～10)、Readyprep2-Dcleanup試劑盒、礦物油購自Bio-rad公司；DTT為Merck產品；其余化學試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1樣品制備

采用本實驗室建立的方法進行樣品前處理。

制備樣品采用Bradford法[16]對樣品蛋白液進行含量測定，上樣緩沖液稀釋至2μg·μL-1。

2.2雙向電泳(2-DE)

采用17 cm、pH3～10 IPG預制膠條，被動水化上樣，上樣量為600 μg(上樣體積300 μL)[17]。

2.3染色

電泳結束后，采用BlueSilver染色法進行凝膠染色[18]。

2.4掃描及圖像分析

染色后采用GEImageScannerIII投射掃描記錄，Imagemaster7.0雙向電泳分析軟件進行圖譜分析。

2.5膠內蛋白質酶解

膠內蛋白質的脫色、烷基化、脫水消化、萃取按照文獻[17]的方法進行。

2.6質譜分析

取10uL樣品上清液進行質譜儀分析。利用MASCOTServe軟件檢索數據庫鑒定信息，得質譜結果。

3 結果

3.1雙向電泳方法學研究

優化雙向電泳方法后，取冬蟲夏草適量制樣后，在同等條件下進行2-DE，重復3次。BlueSilver染色后，采用GEImageScannerIII掃描儀透射掃描凝膠，Imagemaster7.0軟件分析自動點檢測，平均檢測蛋白點數為(827±34)個。見圖1。以其中一塊膠為參比膠進行3塊凝膠間的蛋白質點匹配，平均匹配點數為711個，匹配率為86%。選擇3塊凝膠中相互匹配且分辨清晰的50個蛋白點，選擇位置偏中間的一個點為原點，以參比膠為參考位置進行測量，發現在等點聚焦(IEF)方向上其平均偏差為(1.64±0.23)mm，在SDS方向上其平均偏差為(2.09±0.36)mm。表明所建立的2-DE方法對冬蟲夏草蛋白質具有良好的分辨率和重現性。

注：a、b、c為三次重復。圖1 雙向電泳重復性試驗圖譜(n=3)

3.2冬蟲夏草共有蛋白分析

采用Imagemaster7.0雙向電泳分析軟件進行圖譜分析，將所有冬蟲夏草樣品設為一組，以樣品1圖譜為參考膠，進行組內匹配分析。見圖2。以各圖譜間匹配蛋白點為共同點，經圖譜分析得到共同表達蛋白點88個。

圖2 正品冬蟲夏草共有蛋白質斑點檢測圖

3.3冬蟲夏草指標性蛋白質(差異蛋白質)研究

利用Imagemaster7.0軟件對各產地冬蟲夏草2-DE圖譜進行匹配分析后，建立平均凝膠圖作為參比膠，各蟲草2-DE圖譜為分析膠組間匹配，進行差異表達分析，以平均凝膠圖譜中存在而不同組間無法匹配的蛋白點為差異點。經過分析后得到差異表達蛋白點21個。

理論上這21種蛋白質均可作為冬蟲夏草鑒定的指標性組分，從實際操作上可選擇豐度較高的蛋白質作為其指標性蛋白質進行鑒定研究。見圖3。

圖3 21個指標性蛋白質(差異蛋白質)圖譜

3.4質譜分析結果

將獲得的21種蛋白質N-端序列與NCBI蛋白質數據庫中進行比對。6種蛋白僅來自于菌數據庫，9種蛋白僅來自于昆蟲數據庫，12種蛋白僅來自于全庫，3種蛋白昆蟲和菌的數據庫均能檢索，1種蛋白僅來自于菌數據庫和全庫。見表2～4。

表2 蛋白質檢索來源

表3 21個指標性蛋白質按等電點范圍分類

表4 21個指標性蛋白按分子量范圍分類

4 討論

首次采用高分辨率2-DE技術對不同產地冬蟲夏草和其他種蟲草進行差異蛋白組學研究，建立各種蟲草蛋白質雙向電泳圖譜，比對冬蟲夏草與其他種蟲草蛋白質表達的差異，驗證得到21個冬蟲夏草指標性蛋白質。課題組后期將繼續增加冬蟲夏草及混偽品樣本量，以及使用不同pH范圍IPG膠條獲得更高分辨率電泳圖譜，對差異蛋白斑點進行反復驗證。2-DE對分離低豐度蛋白、極酸極堿蛋白、極大(>200 kD)、極小蛋白(<10 kD)以及難溶蛋白，如膜蛋白等有局限性[19]，同時高豐度蛋白干擾低豐度蛋白檢出率，掩蓋分子量相似的低豐度蛋白質，限制其裝載容量，同時影響聚焦效果[20]。本課題2-DE檢出可分析斑點平均為(537±25)個，且功能性蛋白質大多屬于低豐度蛋白，可預先使用親和層析等方法除去部分高豐度蛋白，將獲得分辨率更高、蛋白質信息更加豐富的電泳圖譜，為后續分離更多功能性蛋白質奠定基礎。

差異斑點大多分布在pH 4.5～6.5，分子量20～50 kD，15～25 kD范圍內蛋白質僅3種，提示可選擇低分子量蛋白質進行下一步制備。

6種蛋白僅來自于菌數據庫，9種蛋白僅來自于昆蟲數據庫，12種蛋白僅來自于全庫，3種蛋白昆蟲和菌的數據庫均能檢索，1種蛋白僅來自于菌數據庫和全庫?？赡転槎x夏草菌在浸染蝙蝠蛾科蝠蛾屬昆蟲幼蟲過程中形成的特殊產物，對深入了解冬蟲夏草菌特異性浸染機制、冬蟲夏草特殊藥理作用相關蛋白質具有重要意義。提示后期可針對篩選得到的具生物活性差異蛋白來源選取相應冬蟲夏草子座或蟲體。

本研究首次利用蛋白組學技術篩選到冬蟲夏草特有的21種蛋白質，下一步可以作為指標性組分進行鑒定研究與實踐。動物藥及種子果實類中藥蛋白質含量豐富，在現有鑒定方案難以突破的前提下，嘗試蛋白質組學的高通量篩選技術無疑是一種有意義的嘗試。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 楊大榮，彭艷瓊，陳吉岳，等.冬蟲夏草生態地理分布規律[N].農民日報，2010-02-02.

[3] Jinlin Guo，Xueyan Liu，Kahoru Kanari.TOWARDS SUSTAINABLE LIVELIHOODS FROM WILD MEDICINAL RESOURCES：Economic aspects of harvesting and trading the Chinese Caterpillar Fungus Ophiocordyceps sinensis and Southern Shisandra Schisandra sphenanthera in China’s Upper Yangtze Ecoregion[J].TRAFFIC Bulletin，2012，24(1)：16-18

[4] 康帥.冬蟲夏草與其混淆品的生藥學鑒別研究[D].北京：中國食品藥品檢定研究院，2011.

[5] 康帥，張繼，林瑞超.冬蟲夏草的性狀和顯微鑒定研究[J].藥學學報，2013，48(3)：428-434.

[6] 胡詠川，田國鑫.冬蟲夏草性狀鑒別與含量標準存在的問題[J].中國藥房，2012，22(47)：4502-4504.

[7] 梁宗琦，韓燕峰，梁建東，等.冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis研究中幾個值得關注的問題[J].微生物學通報，2010，37(11)：1692-1697.

[8] 鄒贏鋅，陳雅琳，儲智勇，等.冬蟲夏草成分及活性研究進展[J].海軍醫學雜志，2014，35(1)：83-84.

[9] 王永田，田連營，劉燦坤.冬蟲夏草質量及真偽的經驗鑒別[J].中醫臨床研究，2012，4(12)：24-25.

[10]唐毅，陳仕江，馬開森.名貴中藥材冬蟲夏草的真偽經驗鑒別[J].重慶中草藥研究，2009，1(2)：1-3.

[11]王林萍，余意，馮成強.冬蟲夏草活性成分及藥理作用研究進展[J].中國中醫藥信息雜志，2014，21(7)：132-136.

[12]韓貴香.冬蟲夏草及蟲草制品中活性成分檢測方法的建立及含量測定[J].臨床醫藥文獻雜志，2014(5)：56.

[13]C C Hsu，Y L Huang，S J Tsai,et al.In vivo and in vitro stimulatory effects of Cordyceps sinensis on testosterone production in mouse Leydig cells[J].Life Sciences，2003，13(16)：2127-2136.

[14]Hu Z，Xia M Q，Tu L Q，et al.Purification and characterizati on of an antibacteriaI protein from the cultured mycelia of Cordyceps sinensis[J].Wuhan University Journal of Natural Sciences，2006，11(3)：709-714.

[15]陳璐.名貴中藥冬蟲夏草特征性蛋白質成分與鑒定方法研究[D].成都：成都中醫藥大學，2011.

[16]N J kruger.Methods in molecular biology[M]New York:Humana Press，2009，80：461-463.

[17]任艷.名貴中藥冬蟲夏草品種及蛋白組分研究[D].成都：成都中醫藥大學，2013.

[18]Giovanni Candiano，Maurizio Bruschi，Luca Musante.Blue silver：A very sensitive colloidal Coomassie G-250staining for proteome analysis[J].Electrophoresis，2004，25：1327-1333.

[19]O’Farrell P H.High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[J].Journal of biological chemistry，1975，250(10)：4007-4021.

[20]金濤，張凱，孫莉，等.去除高豐度蛋白質對腦脊液差異蛋白鑒定的影響[J].中國實驗診斷學，2013，17(1)：52-55.

StudyonCharacteristicProteinsandIdentificationofOphiocordycepssinensisUsing2-DElectrophoresis

TONG Xinxin1，WANG Yixuan1，CHEN Lu1，QIU Yi1，WAN Deguang1，REN Yan1，PENG Cheng1，SHEN Caihong2，LI Junde3，GUO Jinlin1,2*

(1.Key Laboratory of Standardization of Chinese Medicine，Ministry of Education，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，611137，China；2.LuzhouLaoJiao Co.，Ltd.，Luzhou，646000，China；3.National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，100700，China)

The study is aimed to establish an efficient two-dimensional gel electrophoresis protocol for proteomic studying ofOphiocordycepssinensis.Using two-dimensional electrophoresis，a proteomic analysis ofO.sinensisfrom different areas and other Cordyceps fungi were compared.88 kinds of proteins inO.sinensiswere found.Compared with other Cordyceps fungi，21 kinds of characteristic proteins spots inO.sinensiswere found.These indicated that the 21 kinds of proteins were able to be used to authenticateO.sinensisfrom other Cordyceps fungi.Then further analysis of the proteins Mass Spectra Database of NCBI，6 kinds of proteins came from the fungi database，6 kinds of proteins from insect database，12 kinds of proteins from the total database，3 kinds of proteins were found both in insect database and fungi database，1 kinds of proteins was found in the fungi database and total database.These indicate that further study is needed for some function protein.

Ophiocordycepssinensis；characteristic proteins；2-D electrophoresis(2-DE)；function protein

國家自然科學基金(30801522，81373920)

] 國錦琳，博士，教授，研究方向：名貴中藥資源與鑒定；Tel：(028)85214048，E-mail：guo596@163.om

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.005

2016-09-02)

*[