草莓根尖脫毒組培及無病毒苗繁育技術(shù)研究

錢長根+汪霞+朱造杰+周素梅+秦偉+嚴(yán)成其

摘 要：針對傳統(tǒng)的草莓莖尖脫毒組培技術(shù)所存在的操作繁瑣、效率低、消毒難徹底、組培苗污染率高等問題，課題組根據(jù)多年試驗研究成果，提出了一種操作簡便、效率高、消毒易徹底、組培苗污染率低、繁殖速度快，苗質(zhì)好的草莓根尖脫病毒組培及其病毒快速檢測技術(shù)，摸索出一套草莓根尖脫病毒組培快繁及規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)。

關(guān)鍵詞：草莓；根尖脫毒；組培快繁；病毒檢測；無病毒苗繁育

中圖分類號 S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）17-0052-02

我國是世界上草莓野生資源最為豐富的國家，很早就開始利用野生草莓，并一直沿用至今。20世紀(jì)80年代以來，我國草莓生產(chǎn)發(fā)展迅速，目前其生產(chǎn)面積已位居世界第一。其中主要生產(chǎn)地分布在安徽、遼寧、河北、山東、江蘇、上海、浙江、四川、新疆、北京等地區(qū)。但由于草莓是草本植物，長期靠匍匐莖繁殖，易受病毒病的嚴(yán)重危害。

1 病毒對草莓的危害

為害草莓的病毒和類病毒種類繁多，約有28種，主要有輕型黃邊病毒（Strawberry mild yellow edge virus，“SMYEV”）、鑲脈病毒（strawberry vein banding virus，“SVBV”）、皺縮病毒（Strawberry crinkle virus，“SCV ”或“SCrV”）、斑駁病毒（strawberry mottle virus，“SMoV”）等。許多病毒侵染草莓后早期癥狀不明顯，給病害防治帶來了很大困難。如：草莓輕型黃邊病毒單獨侵染栽培種草莓苗后，使草莓早期生長勢變?nèi)酢⒅仓贻p微矮化，后期產(chǎn)量和果實品質(zhì)嚴(yán)重下降，減產(chǎn)率高達(dá)25%。草莓斑駁病毒單獨侵染栽培種草莓苗時，早期癥狀也不明顯，只有當(dāng)它與其他病毒復(fù)合侵染草莓苗時才表現(xiàn)出斑駁癥狀；但草莓植株受此病毒侵染后，病株長勢會逐漸衰退，產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，減產(chǎn)率達(dá)20%～30%。草莓鑲脈病毒單獨侵染栽培種草莓苗時，無明顯癥狀，但會使草莓植株生長勢衰弱，匍匐莖抽生量減少、繁殖力減弱，產(chǎn)量和品質(zhì)下降；當(dāng)它與斑駁病毒、輕型黃邊病毒復(fù)合侵染后，會引起病株葉片皺縮、扭曲，植株極度矮化。與前述3種病毒不同的是草莓皺縮病毒，它是對草莓危害性最大的病毒病。受它侵染的草莓病株前期發(fā)病癥狀較為明顯，葉片變小、畸形，并產(chǎn)生褪綠病斑，沿葉脈出現(xiàn)小而不規(guī)則的褪綠斑、壞死斑，葉脈褪綠、透明，幼葉生長不對稱、扭曲皺縮，小葉黃化，葉柄變短；植株矮化，匍匐莖抽生量減少，繁殖力下降，果實變小，單獨侵染時減產(chǎn)率高達(dá)35%～40%；與其他病毒復(fù)合侵染時，減產(chǎn)率會更高，甚至絕產(chǎn)。防治草莓病毒最好的方法是選用新品種或通過草莓根莖尖脫病毒與組培快繁技術(shù)生產(chǎn)無病毒種苗。

2 草莓根尖脫毒與組培快繁技術(shù)

針對傳統(tǒng)的草莓莖尖脫毒組培技術(shù)所存在的操作繁瑣、效率低、消毒難徹底、組培苗污染率高等問題，項目組研究出了一種操作簡便、效率高、消毒易徹底、組培苗污染率低、繁殖速度快，苗質(zhì)好并與病毒檢測技術(shù)相配套的草莓根尖脫病毒與組培快繁技術(shù)。

2.1 材料預(yù)處理及外植體選取與消毒 （1）材料預(yù)處理。采用先熱處理母株，然后切取根莖頂芽進(jìn)行頂端分生組織培養(yǎng)的方法，可除去部分單用根莖尖培養(yǎng)難以汰除的病毒。處理方法是，將草莓苗放入經(jīng)消毒滅菌的細(xì)沙內(nèi)，在37℃±2℃條件下進(jìn)行熱處理6～12周，直至抽生出根系。（2）根尖外植體的選取與消毒。切取長約1～2cm的主根根尖，經(jīng)70%～75%酒精消毒30s，0.1%升汞加一滴土溫?fù)u動消毒8min，以及無菌水沖洗3～5次后，在實體顯微鏡下將前端長約0.1～0.2mm的根尖切下作為外植體，備用。

2.2 幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng) （1）誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)。將經(jīng)消毒滅菌的根尖外植體接種于根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。首先，在室溫25℃±2℃，光照強度1000±200lx，光照時間16h±2h∕d的條件下培養(yǎng)4周；然后，將光照強度提高至2000±500lx培養(yǎng)6周，最后，將光照強度增強至4000±500lx，持續(xù)培養(yǎng)直至從根尖誘導(dǎo)出草莓再生植株的幼芽。（2）培養(yǎng)基配制。經(jīng)試驗研究，草莓根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基配方為，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO4 50mg/L+6-BA0.3～0.5mg/L+2.4-D 0.1～0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、瓊脂7～9g/L。培養(yǎng)基適宜pH值5.6～5.8。

2.3 脫毒苗增殖培養(yǎng) （1）增殖培養(yǎng)技術(shù)。將從根尖誘導(dǎo)出的草莓再生植株幼芽接種于增殖培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度控制在25℃±2℃，光照強度控制在2000～3000lx，光照時間為16h±2h∕d，持續(xù)培養(yǎng)3～4周，直至長成帶3～5個分蘗的小苗。以后每隔3～4周進(jìn)行1次增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)，直至草莓脫病毒苗數(shù)滿足繁育需要。（2）培養(yǎng)基配制。經(jīng)試驗研究，草莓脫病毒增殖培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基配方為，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO4 50mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+ NAA 0.1～0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、瓊脂7～9g/L。培養(yǎng)基適宜pH值5.6～5.8。

2.4 脫毒苗繼代培養(yǎng) （1）繼代培養(yǎng)技術(shù)。將草莓脫病毒小苗剪成1～3cm長的小段，接種在繼代培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度控制在25℃±3℃，光照強度控制在2500±500lx，光照時間為16h±2h∕d。持續(xù)培養(yǎng)直至長成8～10cm長的草莓無病毒小苗。（2）培養(yǎng)基配制。經(jīng)試驗研究，草莓脫病毒苗繼代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基配方為，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO450mg/L+6-BA 0.1～0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、瓊脂7～9g/L。培養(yǎng)基適宜pH值5.6～5.8。endprint

2.5 幼苗生根培養(yǎng) （1）生根培養(yǎng)技術(shù)。將繼代擴(kuò)增培養(yǎng)成的草莓無病毒小苗接種于生根培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度控制在25℃±3℃，光照強度控制在2000～3000lx，光照時間在16h±2h/d。持續(xù)培養(yǎng)1～2周后逐漸長出根系，繼而長成完整的草莓脫病毒組培苗。（2）培養(yǎng)基配制。經(jīng)試驗研究，草莓脫病毒幼苗生根培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基配方為，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO4 50mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、瓊脂7～9g/L。培養(yǎng)基適宜pH值5.6～5.8。

3 草莓無病毒苗繁育技術(shù)

3.1 組培苗病毒檢測 目前，危害草莓最為嚴(yán)重的輕型黃邊病毒（“SMYEV”）、鑲脈病毒（“SVBV”）、皺縮病毒（“SCrV”）、斑駁病毒（“SMoV”）等4種主要病毒，均具有難以分離、純化的特點。針對這一特點，課題組采用多重RT-PCR同步快速檢測技術(shù)，對草莓試管苗進(jìn)行高靈敏度的病毒檢測，該技術(shù)無需分離、純化，就能快速對草莓組培試管苗或植株進(jìn)行是否帶有這4種主要病毒以及帶有其中的哪一種病毒的快速檢測和鑒別。

3.2 組培苗煉苗移栽 組培瓶苗長至10cm后，直接打開培養(yǎng)瓶蓋，加入少量純凈水，水量以高過培養(yǎng)基2cm為宜，定時觀察續(xù)水，7d后用溫水將幼苗根部的培養(yǎng)基充分洗凈。然后，放入裝有10ml1/2MS+IAA 0.3mg/L水溶液的三角瓶中，15d后移栽至苗床。宜選105孔的標(biāo)準(zhǔn)穴盤作苗床；栽植基質(zhì)宜采用按1∶1∶1的比例混合的草炭、蛭石、珍珠巖混合基質(zhì)，發(fā)揮其蓄水保肥性強、透氣性好的優(yōu)勢。移栽前要讓基質(zhì)充分吸足水分，并消毒處理，以防苗期病害危害。移栽時，宜輕取輕放、控制力度，避免損傷幼苗嫩莖。移栽后，及時覆膜保濕，每天中午揭膜透氣，后期宜逐步揭開，防止幼苗失水萎蔫。

3.3 草莓無病毒苗繁育 在草莓無病毒苗繁育過程中，最為重要的是防止病毒感染。原種苗繁育過程中要防止蚜蟲和葉蟬為害傳毒，宜選擇網(wǎng)室內(nèi)繁育。生產(chǎn)用種苗要在隔離條件下的專用苗圃內(nèi)繁育，離周圍草莓種植地至少3km。避免用栽過草莓的重茬地繁育草莓無病毒苗，并注意定期防治蚜蟲、葉蟬為害。草莓無病毒苗的繁育主要采用匍匐莖繁殖法，其分生量大、速度快、苗質(zhì)量好。在浙北，匍匐莖的開始期在5月下旬，發(fā)生高峰期在6—7月上中旬，可一直延續(xù)到8月中旬。為獲得更多的健壯匍匐莖苗，前期要加強管理：一是要在匍匐莖苗發(fā)生前期，及時追肥、灌水、松土、除草；匍匐莖大量發(fā)生時，宜用人工拔除雜草。二是要及時疏花，疏去整個花序，抑制生殖生長，促進(jìn)營養(yǎng)生長。三是要及時對母株基部壅土、培土，培土厚度以埋住新根而露出苗心為宜。8月下旬開始，要控制草莓植株生長，防止長勢過旺。

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（責(zé)編：徐煥斗）endprint