菲律賓蛤仔過敏原的性質研究

黃姝玲

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

菲律賓蛤仔過敏原的性質研究

黃姝玲

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

文章以菲律賓蛤仔為對象，對其過敏原進行性質研究。采用丙酮沉淀、等電點沉淀、硫酸銨鹽析及加熱處理等方法純化過敏原；采用SDS-PAGE和Western-blot鑒定該過敏原；通過pH穩定性試驗、消化穩定性試驗進一步分析其性質。結果顯示菲律賓蛤仔中主要過敏原的分子量為35kDa，耐酸堿性良好，且具有較高的消化穩定性，其降解產物仍具有抗原性。研究驗證了菲律賓蛤仔中的主要過敏原是原肌球蛋白（tropomyosin，TM），并對其性質進行了分析，為過敏原的安全控制提供了基礎數據。

菲律賓蛤仔；過敏原；原肌球蛋白；性質研究

過敏原是過敏發生的必要條件，是指能發生過敏反應的抗原，常見的有2000-3000種，醫學文獻記載接近2萬種。與其他過敏原相比，食物過敏原的種類更多，成分更復雜，環境影響因素也較多。

貝類是最優質的食用蛋白質資源之一，但貝類引起的過敏性現象較為常見，屬于聯合國糧農組織公布的8大類容易引起過敏的食物之一[1-2]。菲律賓蛤仔，是我國四大養殖貝類之一，產量占全世界的90%以上[3]。蛤肉蛋白質含量高，脂肪含量低且含人體所需的必需氨基酸種類齊全，同時，富含脂肪酸、EPA和DHA，具有良好的保健作用[4]，深受消費者的喜愛，但其卻是引發人過敏反應較為常見的食用貝類之一。

研究以菲律賓蛤仔為對象，對其主要過敏原進行分離純化，并通過SDS-PAGE分析其純化效果與分子量大小，隨之進行pH穩定性的研究，再通過模擬胃腸液消化實驗分析其消化穩定性并在此基礎上采用熱處理方法研究加工工藝對菲律賓蛤仔主要過敏原的影響，同時通過Western-blot來檢測其抗原性。此研究可為開發低過敏原甚至無過敏性的可食用貝類食品提供基礎研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮的菲律賓蛤仔購于廈門市集美菜市場，取肉后立即進行實驗；Tris Base：美國Novon；SDS、TEMED（四甲基一烯二銨）、Pancreatin、麗春紅：美國Sigma；丙烯酰胺：美國Bio-Rad；脫脂奶粉：中國內蒙古伊利實業集團股份有限公司；DTT：美國Bio-Rdd；APS、考馬斯亮藍R-250：中國廈門星隆達化學試劑有限公司；Glycine：美國Promega；β-巰基乙醇：美國Bio-Basic-Inc；Tween-20， C.P.：中國醫藥集團上海化學試劑公司；預染標準蛋白：美國New Egnland Biolabs。

垂直電泳槽Mini protean：美國Bio-Rad；電轉移裝置PS-9：中國Jim-X；冷凍離心機Avanti-25：美國Beckman；凝膠成像儀Bio-profile：法國Vibler Lourmat；凝膠成像儀Alpha：美國Proteinsimple；超純水系統RIOS8：美國Millipore

1.2 實驗方法

1.2.1 菲律賓蛤仔過敏原的純化[5]

取蛤肉100g，加入10倍體積Buffer A（50mmol/L KCl，2mmol/L NaHCO3，10 mmol/L EDTA），搗碎勻漿，4℃離心，取沉淀重復操作4次，取上清；丙酮攪拌過濾，風干；加入10倍體積的Buffer B（20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L β-巰基乙醇），4℃離心，得上清；調節pH至4.5，充分沉淀，4℃離心，取沉淀，用20mmol/L Tris-HCl（pH7.5）溶解；加入41%～60%(NH4)2SO4，攪拌，靜置，4℃離心，所得沉淀溶于20mmol/L Tris-HCl（pH7.5）并于95℃水浴10min，4℃離心，所得的上清溶液分裝并于-20℃保存。

1.2.2 菲律賓蛤仔過敏原pH穩定性的研究

將純化過敏蛋白分別加入不同pH值的緩沖液中（pH值1.0、2.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、13.0），置于4℃冰箱內分別反應0.5h和6h，之后取出，調節pH至7.0，立即進行SDS化，以置于pH7.0緩沖液的樣品為對照。

1.2.3 菲律賓蛤仔過敏原消化穩定性的研究

1.2.3.1 體外模擬胃液消化[6]

總反應體系為1mL，胃蛋白酶（12 U/mg）與純化過敏蛋白的比例為1:50（w:w）。將含有胃蛋白酶的模擬胃液SGF（50mmol/L NaCl，pH1.2）于37℃預熱15min，加入純化的過敏蛋白混勻，振蕩反應；分別在反應0、1、2、5、10、15、30、60 min時取100 μL反應液，加入30μL、200mmol/L Na2CO3混勻，置于冰上。對照試驗不加胃蛋白酶。

1.2.3.2 體外模擬腸液消化[7]

總反應體系為1mL，胰蛋白酶（390 U/mg）與純化的過敏蛋白比例為1:50（w:w），胰凝乳蛋白酶（360 U/mg）與底物的比例是1:1000（w:w）。將含有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的模擬腸液S I F（50mmol/L KH2PO4，pH7.5）在37℃預熱15min，加入純化的過敏蛋白混勻，振蕩反應；分別在反應0、1、5、15、30、60、120、240 min時取100μL反應液，95℃加熱5min，置于冰上。對照反應不加蛋白酶。

1.2.3.3 二相模擬胃腸液消化實驗

將含有胃蛋白酶的SGF于37℃預熱15min，加入純化的過敏蛋白混勻，反應一定時間后取出100μL反應液，加入30μL 200mmol/L Na2CO3，混勻后置于冰上。加入Na2CO3中和終止反應并使消化環境pH值在7.5左右，加入胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶或胰酶，反應一定時間后取100μL反應液，95℃下加熱5min，置于冰上。其中，0min樣品是將含有蛋白酶的SGF與SIF先加熱失活終止反應，再加入底物。對照反應不加蛋白酶，其余步驟相同。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析

各階段的純化效果及純化蛋白質的分子量用SDS-PAGE分析，以分子量為116.0-14.4kDa的標準蛋白質作為對照，方法是在Leammli等[8]的基礎上略作改動。分離膠和積層膠濃度均為12%，上樣量為8 μL，Marker上樣量為4μL，染色液為考馬斯亮藍R250。

1.2.5 Western-blotting免疫分析

Western-blotting參照Towbin[9]等的方法進行。標準蛋白使用Prestained Marker，染液為麗春紅，用5%脫脂奶粉作封閉液，兔抗鋸緣青蟹TM特異性多克隆抗體作為一抗，羊抗兔多克隆抗體作為二抗，鋸緣青蟹TM作為陽性對照，牛血清蛋白（BSA）作為陰性對照，并采用ECL法進行顯色。

2 結果與分析

2.1 菲律賓蛤仔過敏原的分離純化結果與Westernblotting確認

菲律賓蛤仔肉經過丙酮沉淀、等電點沉淀、硫酸銨鹽析及加熱處理等方法處理后，分離得到純化的過敏原，進行SDS-PAGE分析，結果如圖1所示，該過敏原分子量在35kDa左右。

圖1 菲律賓蛤仔主要過敏原純化電泳圖

據國內外研究表明，蝦和貝類動物中的主要過敏原為原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm），是一種種間交叉反應明顯的糖蛋白[10-11]。研究以此為據，將通過電泳分離得到的菲律賓蛤仔蛋白質凝膠進行Western-blotting免疫分析，主要以兔抗鋸緣青蟹TM特異性多克隆抗體作為一抗、鋸緣青蟹TM為陽性對照進行分析。經ECL顯色，結果如圖2所示，純化的過敏蛋白（泳道1）和青蟹TM（泳道2）均與抗體發生陽性反應，而BSA（泳道3）未與抗體發生特異性結合。因此，可確認菲律賓蛤仔中的主要過敏蛋白為原肌球蛋白。

圖2 純化蛤仔TM的Western-blot分析

2.2 菲律賓蛤仔過敏原pH穩定性的SDS-PAGE分析

菲律賓蛤仔原肌球蛋白pH穩定性試驗結果如圖3所示，在不同pH條件下，分別反應0.5h（圖3a）與6h（圖3b），TM條帶均未出現消減現象，由此說明菲律賓蛤仔TM在酸堿條件下都具有良好的穩定性。

圖3 純化蛤仔過敏蛋白的pH穩定性電泳圖

2.3 純化菲律賓蛤仔TM的模擬胃腸液消化試驗分析

2.3.1 純化菲律賓蛤仔TM單相模擬胃腸液消化

純化菲律賓蛤仔TM的體外SGF、SIF消化結果見圖4。從圖中可知，胃蛋白酶與蛤仔TM比例為1/50進行SGF消化，條帶幾乎沒有發生變化，消化1h后TM仍然沒有被降解，說明TM對胃蛋白酶有很強的耐降解性（圖4a）；而胰蛋白酶與蛤仔TM以1/100的比例反應，1min后TM即開始降解，60min后，TM被完全分解，隨著反應時間的延長，在20～30 kDa之間也逐漸產生降解條帶，消化4h后，僅在20 kDa處能觀察到一條微弱的蛋白條帶（圖4b）。同樣的，胰凝乳蛋白酶與TM以比值為1/1000進行實驗，反應1min TM即開始降解，隨著反應時間的延長，原始TM條帶被分解，并主要在30 kDa左右逐漸產生降解條帶，消化4h后，在30kDa處仍能觀察到一條清晰的蛋白條帶（圖4c）。

圖4 純化蛤仔原肌球蛋白的模擬胃腸液消化

圖5 純化蛤仔原肌球蛋白的模擬二相胃腸液消化

2.3.2 純化菲律賓蛤仔TM二相模擬胃腸液消化

人的消化過程是由口腔開始，經食道進入胃，再由小腸進行消化與營養吸收，一般而言，食物在胃部停留30～60min，在小腸停留約8h。過敏原若未經過胃蛋白酶消化，可能導致胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位點不會完全暴露出來。同時，相比于胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶，胰酶更接近于人體內小腸中的消化酶。因此，按照人體的消化順序、消化時間分別進行了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對TM的消化試驗以及胃蛋白酶與胰酶對TM的消化試驗，然后通過SDS-PAGE分析，進行對比。如圖5所示，菲律賓蛤仔TM對胃蛋白酶有較強的穩定性，反應60 min完全沒有被降解（圖5a，圖5c）；相比之下，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶反應15 min，菲律賓蛤仔TM即開始降解，但在240 min后蛋白原始條帶仍然未完全降解（圖5b）；胰酶對菲律賓蛤仔TM的消解效果與之相似，反應15 min出現降解條帶，但在240 min后原始蛋白條帶被完全降解(圖5d)。推測可能是由于胰酶中含有更多種類的消化酶從而促使了菲律賓蛤仔TM的降解。總體而言，2組實驗對TM的降解效果差異不明顯。

圖6 免疫印跡檢測模擬胃腸液對TM的消化情況

2.4 純化菲律賓蛤仔TM模擬胃腸液消化Westernblotting分析

為了確認蛤仔TM經消化降解后其抗原性的變化情況，采用兔抗青蟹TM特異性多克隆抗體以Western-blot鑒定TM的降解過程及其產物。圖6a顯示，胃蛋白酶對原肌球蛋白的降解作用微弱，反應60min后，主條帶仍然未被降解，其抗原性也沒有發生明顯的變化。在模擬腸液消化實驗中，以胰蛋白酶作為消化酶時，反應5min即有降解產物生成，并在30kDa和23kDa處產生降解條帶。隨著反應時間的延長，這些降解條帶被進一步分解（圖6b），這些降解條帶都存在一定的抗原性。胰凝乳蛋白酶分解TM的結果與胰蛋白酶相似，但胰凝乳蛋白酶作用后主要在28 kDa處產生1條帶（圖6c）。不同的酶作用TM產生的降解條帶不同，這與消化酶對底物的作用位點不同有關。

3 討論與結論

雖然已有研究證實原肌球蛋白是貝類動物的主要過敏原，但是不能排除不同物種間存在差異的可能性。文章以菲律賓蛤仔為研究對象，通過分離得到純化的過敏原，采用免疫印跡法，以兔抗青蟹TM特異性多克隆抗體對其進行分析，結果顯示該致敏蛋白分子量為35kDa，同國內報道的原肌球蛋白分子量相近[12]，并且與蟹類TM抗體具有較強的交叉反應，故確認菲律賓蛤仔中的主要過敏蛋白為原肌球蛋白TM。

過敏原通常具有良好的穩定性，文章對TM的pH穩定性和消化穩定性進行了研究、分析。從pH穩定性試驗的結果可以看出，TM在不同酸堿環境中均能保持良好的穩定性，由此可知，當人體攝入TM后，胃酸并不能使TM降解；研究模擬人體消化酶對菲律賓蛤仔過敏蛋白的分解作用，結果表明TM對胃蛋白酶具有很強的耐消化性，酶/蛋白比值為1/50（w/w）反應60min后，TM仍然沒有被降解；胰蛋白酶與蛤仔TM反應，1min后TM即出現微弱的降解，60min后原始蛋白條帶已被完全降解，在分子量為23、30 kDa處出現降解產物條帶。同樣的，TM與胰凝乳蛋白酶反應1min開始出現降解，并在28kDa左右出現降解條帶，隨后繼續消化1h，僅剩下小分子量的降解產物，TM原始蛋白條帶完全被分解。該結果與其他學者對食品過敏原的消化特征的研究結果相似[13，14]。菲律賓蛤仔TM被3種蛋白酶降解過程中，產生不同分子量的降解條帶，主要是因為不同消化酶對肽段的特異性分解位點不同所致[15]。如胰蛋白酶特異選擇Lys和Arg殘基的P1位置，而胰凝乳蛋白酶則優先選擇靠芳香族氨基酸（Tyr，Trp，Phe）和Leu的P1位置。但文章未探討酶解過程中過敏蛋白的結構變化，尚待進一步深入研究分析。

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TS254.7

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：1007-550X（2017）04-0038-06

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.04.003

2017-02-13

黃姝玲（1989-），女，福州永泰人，助理工程師，碩士，主要研究方向：微生物學。