敲除aceA和gogat及過表達gltA對谷氨酸棒狀桿菌GKGD合成α-酮戊二酸的影響

薛寧，李智祥，戰俊杰，趙磊，梁云龍，馮甲，劉濤，徐慶陽, 2, 3，張成林, 2, 3，陳寧, 2, 3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津，300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

敲除aceA和gogat及過表達gltA對谷氨酸棒狀桿菌GKGD合成α-酮戊二酸的影響

薛寧1，李智祥1，戰俊杰1，趙磊1，梁云龍1，馮甲1，劉濤1，徐慶陽1, 2, 3，張成林1, 2, 3，陳寧1, 2, 3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津，300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)在生命活動中具有重要的作用，被廣泛應用于食品、醫藥等領域。以α-KG生產菌谷氨酸棒狀桿菌GKGD為出發菌株，敲除其異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA以增加異檸檬酸供應，獲得GKGD-1，搖瓶發酵條件下其α-KG產量和轉化率分別提高14.72%和9.76%；敲除谷氨酸合酶編碼基因gogat以降低L-谷氨酸生成量，獲得GKGD-2，其α-KG產量和轉化率分別提高7.39%和5.43%，L-谷氨酸生成量降低52.87%；過表達檸檬酸合酶編碼基因gltA以進一步增加前體物供應，獲得GKGD-3，其α-KG產量提高35.9%；于7.5 L發酵罐經30 h發酵，GKGD-3 α-KG產量達49.5 g/L，較出發菌株提高36.4%，L-谷氨酸生成量降低50%。敲除aceA和gogat并過表達gltA可顯著提高α-KG產量并降低L-谷氨酸生成量。

α-酮戊二酸；L-谷氨酸；谷氨酸合酶；異檸檬酸裂解酶；檸檬酸合酶

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)是TCA循環中的重要中間產物，參與氨基酸、維生素、有機酸及能量代謝[1-2]，被廣泛應用于化工、食品、醫藥、日化等領域[3-6]。目前主要采用化學法生產α-KG，但因收率低、氰化物污染等問題制約了其在醫藥和食品等領域的應用[7]。發酵法生產α-KG因具有成本低、收率高、副產物少等優點而被認為具有很大的工業化生產的潛力。

發酵法生產α-酮戊二酸最早始于LOCKWOOD和STODOLA對利用熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)生物合成α-酮戊二酸的研究[7-9]。自20世紀70年代，人們陸續發現耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)等酵母菌亦能過量合成α-酮戊二酸[10-15]。然而利用酵母合成α-KG周期較長(大于120 h)[10-15]。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)具有過量合成L-谷氨酸的能力，而L-谷氨酸主要來源于α-KG的氨基化，因此被認為是具有α-KG生產潛力的微生物[16-17]。在前期研究中，我們以L-谷氨酸生產菌C.glutamicumGDK-9為出發菌株經代謝工程改造獲得的C.glutamicumGKGD α-KG產量達到45.6 g/L[18]。

圖1 谷氨酸棒桿菌α-KG合成途徑及本研究改造策略Fig.1 α-KG synthesis pathway in C.glutamicum and strategy for strain genetic modification in this study

如圖1所示，在谷氨酸棒狀桿菌中，葡萄糖經糖酵解途徑生成丙酮酸并被催化生成草酰乙酸和乙酰-CoA，二者經檸檬酸合酶催化生成檸檬酸，后者經催化生成異檸檬酸，進而經異檸檬酸脫氫酶催化合成α-KG[19]。同時，異檸檬酸可經異檸檬酸裂解酶催化生成乙醛酸和琥珀酸。α-KG主要存在3條代謝途徑：(1) 經α-酮戊二酸脫氫酶氧化為琥珀酸；(2) 經谷氨酸脫氫酶氨基化為L-谷氨酸；(3) 經谷氨酸合酶催化生成L-谷氨酸。在GKGD中，途徑(1)被弱化，途徑(2)被阻斷[18-19]。因此，本研究以GKGD為出發菌株擬采用阻斷乙醛酸循環和谷氨酸合成途徑并增強檸檬酸合成代謝流策略通過敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA和谷氨酸合酶編碼基因gogat并過表達檸檬酸合酶編碼基因gltA以期增加α-KG的合成(圖1)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 菌株及質粒

本研究所用菌株及質粒如表1所示。

表1 菌株及質粒

1.1.2 引物

參考NCBI中C.glutamicumATCC13032aceA和gltA及gogat序列，采用Primer5.0軟件設計引物(表2)。

表2 引物

1.1.3 培養基

利用LB培養基培養大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，必要時添加卡那霉素(50 μg/mL)或氯霉素(30 μg/mL)。

搖瓶種子培養基：葡萄糖 25 g/L，K2HPO4·3H2O 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.9 g/L，尿素3.5 g/L，玉米漿 40 mL/L，豆粕水解液 15 mL/L， pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

搖瓶發酵培養基：葡萄糖 80 g/L， MgSO4·7H2O 1.8 g/L，Na2HPO42.8 g/L，KCl 1.3 g/L，VB10.23 mg/L，MgSO4·7H2O 2.3 mg/L，FeSO4·7H2O 2.3 mg/L，玉米漿 1 mL/L，豆粕水解液 15 mL/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵罐種子培養基：葡萄糖30 g/L，玉米漿35 mL/L，豆粕水解液20 mL/L，K2HPO4·3H2O 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.9 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵罐發酵培養基：葡萄糖80 g/L，Na2HPO43 g/L，KCl 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·7H2O 5 mg/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，ZnSO45 mg/L，VB10.4 mg/L，玉米漿 3 mL/L，豆粕水解液20 mL/L，必要時加入谷氨酸鈉 2 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 試劑

限制性內切酶、T4DNA 連接酶、ExTaq DNA 聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司；PCR 產物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒，北京博邁德生物技術有限公司；異檸檬酸裂解酶試劑盒、檸檬酸合酶試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；α-KG：分析純，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設備

生物傳感儀(SBA-40C)，山東省科學院生物研究所；高效液相色譜儀(Agilent 1100)，美國安捷倫科技公司。

1.3實驗方法

1.3.1 用于aceA和gogat敲除及gltA基因過表達重組質粒的構建

以GKGD基因組為模板利用引物aceA-1和aceA-2及aceA-3和aceA-4獲得aceA基因上下游同源片段，并以其為模板利用引物aceA-1和aceA-4獲得重組片段?；厥蘸蠼汦coR I和SalI雙酶切、電泳、回收并連接pK18mobsacB后轉化至E.coliDH5α中。經篩選后提取重組質粒進行酶切驗證，將重組質粒命名為pK18mobsacB△aceA。同理獲得用于gogat敲除的重組質粒pK18mobsacB△gogat。

以GKGD基因組DNA為模板利用引物gltA-1和gltA-2擴增獲得gltA片段，回收后經HindI和EcoRI酶切、回收并連接pXMJ19后轉化至E.coliDH5α中。經篩選后提取重組質粒進行酶切驗證，將重組質粒命名為pX-gltA。

1.3.2 重組菌株GKGD-1、GKGD-2和GKGD-3的構建

取適宜濃度的pK18mobsacB△aceA電轉化至GKGD感受態細胞(2.5 kV，25 μF，200 Ω，1 mm電擊杯)[22]。將電轉后的菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，32 ℃倒置培養36 h后，挑取單菌落活化后提取其基因組DNA并進行PCR鑒定。將陽性轉化子在10%蔗糖的LB搖管中反復傳代后，篩選在LB平板上生長、在含卡那霉素平板上不生長的單菌落，提取其基因組DNA進行PCR驗證，獲得aceA基因缺失菌株GKGD-1。采用相同方法獲得gogat敲除菌株GKGD-2。

提取質粒pXMJ19及pX-gltA電轉化至GKGD-2、將pXMJ19電轉化至GKGD，經活化后涂布于含氯霉素平板進行篩選，挑選單菌落并提取質粒經酶切驗證，分別獲得GKGDpX、GKGD-3和GKGDpM。

1.3.3 酶活性測定

收集培養至對數中期的菌體，分別按異檸檬酸裂解酶試劑盒和檸檬酸合酶試劑盒說明書處理菌體并測定異檸檬酸裂解酶和檸檬酸合酶活性。

1.3.4 搖瓶發酵

將種子培養物按10%的接種量接種至含30 mL搖瓶發酵培養基的500 mL擋板瓶中，于34℃ 200 r/min振蕩培養，維持pH 7.0～7.2。GKGDpM、GKGDpX和GKGD-3 生長至OD600=0.6～0.8時添加0.2 mmol/L的IPTG。

1.3.5 發酵罐發酵

以15%接種量將種子培養物接至含4.5 L發酵培養基的7.5 L發酵罐中，發酵溫度為34℃；通氣量為2～5 L/min，攪拌轉速200～1 000 r/min；分階段控制溶氧：發酵初期維持30%，穩定期維持50%～60%，發酵后期維持40%。待細胞轉型后，以25% NaOH調節pH 7.0～7.2；根據需要流加泡敵消泡。發酵過程中，流加80%～90%的葡萄糖溶液，維持殘糖1%～2%。

1.3.6 葡萄糖、L-谷氨酸和α-KG含量測定及數據分析

采用SBA-40C生物傳感儀測定葡萄糖和L-谷氨酸濃度。

采用Agilent 1100高效液相色譜儀測定α-KG濃度。色譜柱 Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，L×I.D.)；流動相 0.005 mol/L H2SO4；柱溫 30℃；流速 0.5 mL/min；檢測波長 215 nm。

根據公式 DCW= 0.244 5×OD600-0.012 6計算菌體干重(dry cell weight，DCW)。

1.4數據分析

每組實驗均設3個平行并重復3次，利用Origin 8.0和SPSS 13.0統計軟件對實驗數據進行分析和處理。

2 結果與討論

2.1異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA敲除對α-KG合成的影響

異檸檬酸經異檸檬酸裂解酶催化生成乙醛酸和琥珀酸[19]，從而減弱α-KG合成代謝流，故認為阻斷該途徑可為α-KG提供更多的前體物異檸檬酸。將重組質粒pK18mobsacB△aceA轉化至GKGD后經篩選，挑選重組子利用引物aceA-1和aceA-4對其進行PCR鑒定，獲得堿基數約為2 000 bp和1 200 bp的片段，與理論值2 104 bp和1 240 bp一致(圖2)，表明pK18mobsacB△aceA成功整合至GKGD基因組。利用引物aceA-1和aceA-4對第二次重組的重組子進行PCR鑒定，獲得堿基數約為1 200 bp的片段，與理論值1 240 bp一致，表明aceA被成功敲除，命名為GKGD-1。

M-DNA marker；1-以第1次重組的菌株基因組DNA為模板的PCR產物電泳圖譜；2-以第2次重組的菌株(即GKGD-1)基因組DNA為模板的PCR產物電泳圖譜；3-以GKGD基因組DNA為模板的PCR產物電泳圖譜圖2 aceA基因敲除株GKGD-1的PCR鑒定圖譜Fig．2 Map for identification of aceA-knockout strain GKGD-1

分別收集培養至對數中期的GKGD 和GKGD-1菌體細胞測定其異檸檬酸裂解酶活性，結果表明，GKGD-1未檢測到異檸檬酸裂解酶活性，進一步說明aceA被成功敲除(表3)。

表3 各菌株異檸檬酸裂解酶和檸檬酸合酶活性

注：*未檢測到; **：未檢測。

利用GKGD-1進行搖瓶發酵，以測定aceA敲除對其α-KG合成的影響。結果如表4所示，GKGD-1的α-KG產量和轉化率分別為12.86 g/L和8.66%，較出發菌株GKGD分別提高14.72%和9.76%，而其生物量未見明顯變化。

表4 各菌株搖瓶發酵參數

2.2谷氨酸合酶編碼基因gogat敲除對α-KG合成的影響

1分子α-KG和谷氨酰胺經谷氨酸合酶催化生成2分子L-谷氨酸[19]，故推測阻斷該途徑可增強α-KG的積累并減少副產物L-谷氨酸的合成。將重組質粒pK18mobsacB△gogat轉化至GKGD-1后經篩選，挑選重組子利用引物gogat-1和gogat-4對其進行PCR鑒定，獲得堿基數約為4 000 bp 和1 000 bp的片段，與理論值4 328 bp和1 184 bp一致(圖3)，表明pK18mobsacB△gogat成功整合至GKGD-1基因組。利用引物gogat-1和gogat-4對第二次重組的重組子進行PCR鑒定，獲得堿基數約為1 000 bp的片段，與理論值1 184 bp一致，表明gogat被成功敲除，命名為GKGD-2。

利用GKGD-2進行搖瓶發酵，以測定gogat敲除對其α-KG合成的影響。結果如表4所示，GKGD-2的α-KG產量和轉化率分別為13.81 g/L和9.13%，較出發菌株GKGD-1分別提高7.39%和5.43%，較GKGD分別提高21.19%和15.72%，其L-谷氨酸積累量為1.15 g/L，較GKGD-1降低52.87%，而其生物量未見明顯變化。由此可見，阻斷谷氨酸合酶途徑可顯著增強α-KG的積累并減少副產物L-谷氨酸的合成。

2.3過表達檸檬酸合酶編碼基因gltA對α-KG合成的影響

檸檬酸合酶催化檸檬酸合成，是TCA循環中的關鍵酶[19]。以GKGD基因組為模板利用引物gltA-1和gltA-2擴增獲得檸檬酸合酶編碼基因gltA片段(圖3A)，將其克隆并轉化至大腸桿菌E.coliDH5α感受態細胞。將篩選獲得的轉化子活化后提取質粒進行PCR和酶切鑒定。質粒經PCR擴增獲得堿基數為約1 300 bp的片段與理論值1 314 bp一致；質粒經單、雙酶切分別獲得堿基數約為8 000 bp及7 000 bp和1 300 bp的片段，與理論值7 915 bp及6 601 bp和1 314 bp一致(圖4A)，表明質粒構建成功，命名為pX-gltA。將重組質粒pX-gltA轉化至GKGD-2，篩選獲得的轉化子活化后提取質粒進行PCR和酶切鑒定，獲得片段的堿基數與理論值一致(圖4B)，表明菌株構建成功，命名為GKGD-3。分別收集培養至對數中期的GKGD 和GKGD-3菌體細胞測定其檸檬酸合酶活性，發現GKGD-3的檸檬酸合酶活性較GKGD提高112.9%，由此可見，過表達gltA可有效提高檸檬酸合酶活性(表3)。

M-DNA marker；1-以第1次重組的菌株基因組DNA為模板的PCR產物電泳圖譜；2-以第2次重組的菌株(即GKGD-2)基因組DNA為模板的PCR產物電泳圖譜；3-以GKGD-1基因組DNA為模板的PCR產物電泳圖譜圖3 gogat基因敲除株GKGD-2的PCR鑒定圖譜Fig．3 Map for identification of gogat-knockout strain GKGD-2

A:pX-gltA的PCR及酶切鑒定圖譜M-marker；1-以GKGD基因組DNA為模板的PCR產物電泳圖譜；2-以重組質粒pX-gltA為模板PCR產物電泳圖譜；3-重組質粒pX-gltA單酶切產物電泳圖譜； 4-重組質粒pX-gltA雙酶切產物電泳圖譜 B:從GKGD-3提取質粒的PCR及酶切鑒定圖譜 M-marker；1-以從GKGD-3提取質粒的重組質粒pX-gltA為模板PCR產物電泳圖譜；2-從GKGD-3提取質粒的重組質粒pX-gltA的單酶切產物電泳圖譜；3-從GKGD-3提取質粒的重組質粒pX-gltA的雙酶切產物電泳圖譜圖4 gltA基因過表達重組質粒pX-gltA及菌株GKGD-3 PCR鑒定圖譜Fig．4 Map for identification of pX-gltA and GKGD-3

利用GKGD-3進行搖瓶發酵，以測定過表達檸檬酸合酶對其α-KG合成的影響。結果如表4所示，GKGD-3的α-KG產量為14.27 g/L，分別較對照菌株GKGDpX和GKGDpM提高14.16%和35.9%。值得注意的是，與GKGD-2相比GKGD-3 α-KG產量提高不顯著，但其單位菌體產量提高18.01%。其原因可能是質粒造成菌體生長和代謝負擔致使生物量下降12.4%。因此在后續研究中可采用基因整合的方式將gltA啟動子替換為強啟子(如Ptuf等)以增強gltA的表達量同時不影響菌體生物量。

2.4發酵罐條件下GKGD-3的發酵特性

利用重組菌株GKGD-3于7.5 L發酵罐進行發酵實驗，以GKGD和GKGDpM為對照，結果如表5和圖5所示。經30 h發酵，GKGD-3 α-KG產量達到49.5 g/L，分別較對照菌株GKGDpM和GKGD提高36.4 %和9.8%；其單位菌體產量為3.9 g/g，分別較GKGDpM和GKGD提高39.3%和50.0%；L-谷氨酸積累量分別降低60.8%和50.0%；其轉化率分別提高8.8%和4.5%。

表5 菌株于7.5 L發酵罐條件下的發酵參數

圖5 菌株發酵過程曲線Fig.5 Fermentation process curve of strains方形和圓形分別代表生物量和α-KG產量；黑色實心為GKGD；灰色實心為GKGDpM；空心為GKGD-3

3 結論

本研究以α-KG生產菌GKGD為出發菌株，采用增強檸檬酸合成代謝流、阻斷乙醛酸循環及谷氨酸合成途徑策略通過敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA和谷氨酸酶編碼基因gogat并過表達檸檬酸合酶編碼基因gltA使得α-KG產量分別于搖瓶條件和7.5 L發酵罐條件下提高35.9%和36.4%，使得L-谷氨酸生成量分別降低28.8%和50%。由此可見，敲除aceA和gogat并過表達gltA可顯著提高α-KG產量并降低L-谷氨酸生成量。

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EffectofaceAandgogatknockoutcombinedgltAoverexpressioninGKGDonα-ketoglutarateproduction

XUE Ning1, LI Zhi-xiang1, ZHAN Jun-jie1, Zhao Lei1, LIANG Yun-long1,FENG Jia1, LIU Tao1, XU Qing-yang1, 2, 3, ZHANG Cheng-lin1, 2, 3, CHEN Ning1, 2, 3*

1 (Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457， China) 2 (National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China) 3 (Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China)

α-Ketoglutarate (α-KG) plays an important role in life activities and has been widely applied in food and medicine. Isocitrate lyase encoding geneaceAwas knocked out to improve isocitrate supply and obtain GKGD-1, by which the α-KG production and yield was increased by 14.72% and 9.76%. In order, glutamate synthase encodinggenegogat was knocked out to reduceL-glutamate accumulation and thus obtain GKGD-2, by which the α-KG production and yield was increased by 7.39% and 5.43% andL-glutamate was decreased by 52.87%. Citrate synthase encoding genegltAwas overexpressed to further increase precursor supply and thus obtain GKGD-3, by which α-KG production was increased by 35.9%. Fermentation assay was performed in 7.5-L fermentor with GKGD-3, α-KG production achieve 49.5 g/L (increased by 36.4%) andL-glutamate accumulation was decreased by 50%. In summary,aceAandgogatknockout combined withgltAoverexpression in GKGD remarkably improved α-ketoglutarate production.

α-ketoglutarate;L-glutamate; glutamate synthase; lsocitrate lyase; citrate synthase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014419

博士研究生(陳寧教授為通訊作者,E-mail:ningch@tust.edu.cn)。

國家自然科學基金項目(31300069)；天津科技大學青年教師創新基金(2016LG07)；天津市科技支撐計劃重點項目(12ZCZDSY01900)；天津市科委科技特派員項目(15JCTPJC62800)；天津市大學生創新創業訓練計劃項目(201710057039、201510057063)

2017-03-30，改回日期：2017-04-20