米根霉α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關氨基酸的初步分析

田方源，湯斌,2*，李松,2，楊倩

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

米根霉α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關氨基酸的初步分析

田方源1，湯斌1,2*，李松1,2，楊倩1

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

利用計算機輔助模擬分析技術對米根霉α-淀粉酶與麥芽三糖進行分子對接，并選擇可能與該酶的高麥芽糖生成能力相關的氨基酸殘基進行突變和分析。研究表明：突變體YHR和H286L最適作用溫度分別比原酶的最適作用溫度(50 ℃)提高了10 ℃和5 ℃；突變體H286L的最適作用pH下降了0.5。與原酶相比，突變體YHR和H286L作用麥芽三糖終產物中麥芽糖含量分別提高了18.87%和16.87%，作用可溶性淀粉終產物中麥芽糖含量分別提高了11.67%和10.32%。初步確定H286與該酶高麥芽糖生成能力之間的關系最為密切，其次為Y80和R333。

真菌α-淀粉酶；麥芽糖；蛋白質結構；定點突變

工業用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)按微生物來源不同可以分為細菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶2大類[1]。細菌α-淀粉酶水解淀粉的主要產物是糊精及少量寡糖和葡萄糖，其在淀粉質原料的水解過程中主要起到液化作用(如高溫α-淀粉酶)或淀粉乳的降黏作用(如中溫α-淀粉酶)[2]。與細菌α-淀粉不同，真菌α-淀粉酶可以水解淀粉和麥芽三糖，終產物中主要物質為麥芽糖和部分低聚寡糖及少量葡萄糖。其中，真菌來源的α-淀粉酶有很多種，主要指黑曲霉、米曲霉或米根霉等真菌來源并可分泌至細胞外的在蛋白質結構和底物催化特征等方面比較相似的一類α-淀粉酶，在現代研究或工業應用領域統稱為真菌α-淀粉酶[1, 3]。

高麥芽糖漿是一種以麥芽糖為主(通常含量>50%)的淀粉糖，在食品和飲料行業具有廣泛的應用[4-5]。在現代淀粉糖行業，高麥芽糖漿主要采用酶轉化淀粉工藝進行生產。隨著糖化工藝的改進，真菌α-淀粉酶已逐漸替代β-淀粉酶做為主要糖化劑用于高麥芽糖漿的生產，成為高麥芽糖漿生產過程中的關鍵酶制劑[6]。真菌α-淀粉酶之所以能夠替代相對昂貴的β-淀粉酶，是因其具有特殊的產物生成能力——高麥芽糖生成能力。高麥芽糖漿品質的高低依據糖漿中麥芽糖的含量而定，因此，在高麥芽糖漿的工業生產過程中，真菌α-淀粉酶催化水解淀粉所生成的終產物中麥芽糖濃度的高低是評價其應用性能的一個重要特征指標。目前，真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性質研究階段，其中一種研究認為，α-淀粉酶對麥芽三糖的親和力的不同可能對麥芽糖的形成和終產物中麥芽糖的含量具有重要影響[7]；另一種研究認為真菌α-淀粉酶具有高麥芽糖生成能力是由于該淀粉酶可以催化低濃度麥芽三糖發生轉糖基化反應所致[8]。而有關真菌α-淀粉酶結構與其高麥芽糖生成能力之間關系的研究則未見報道，即沒有結合酶蛋白質結構分析從根本的分子水平上加以研究，使得真菌α-淀粉酶的高麥芽糖生成能力及其作用機制一直沒有得到合理的闡釋。

因此，為了在分子水平上研究與真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關的關鍵蛋白結構特征，本研究通過蛋白結構建模和底物對接等生物信息學分析方法初步對米根霉α-淀粉酶中可能與高麥芽糖生成能力相關的關鍵氨基酸進行了分析，并利用定點突變技術獲得了系列突變體。研究中進一步對突變體的結構、理化性質和底物水解特征等進行了分析，以期為深入研究真菌α-淀粉酶的高麥芽糖生成機制及其高麥芽糖生成能力這一重要催化功能的定向進化方法提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，以及質粒pUC57和pPIC9k，為本實驗室保藏；含有米根霉α-淀粉酶基因(ROAmy)的重組質粒pUC57-ROAmy為本實驗室在前期研究工作中構建。其中，基因ROAmy(GenBank：HM234170)克隆自菌株米根霉(Rhizopusoryzae)F0071(中國高校工業微生物資源與信息中心，CICIM—CU)。實驗中所使用的各種限制性核酸內切酶、DNA聚合酶、T4DNA連接酶以及質粒抽提、PCR產物純化和膠回收等試劑盒分別購于寶生物工程(大連)有限公司或生工生物工程(上海)有限公司。酵母氮基(YNB)購于北京拜爾迪生物公司；麥芽寡糖標準品購于日本林原生化研究所公司(Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc)。其他試劑均為國產或進口的生化或分析純試劑。

1.2培養基

LB培養基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.5 g/L；向LB液體培養基中添加15 g/L瓊脂粉即制得LB固體培養基。基本培養基MM、種子培養基YPD、初始發酵培養基BMGY以及誘導發酵培養基BMMY等培養基的配制按照畢赤酵母操作手冊[9]進行。向MM固體培養基中添加5 g/L可溶性淀粉即制得突變體篩選培養基。

1.3儀器與設備

紫外可見光分光光度計，上海精科儀器有限公司，型號：YXLZ820KBSQ；蛋白質純化設備，美國GE Healthcare公司，型號：AKTA-Explorer 100；電穿孔儀，美國BTX公司，型號：ECM 630；Ni親和柱，美國GE Healthcare公司，型號：His TrapTMHP 1 mL；高效液相色譜儀，美國Water公司，型號：Water 1525。

1.4方法

1.4.1 ROAmy分子建模及定點突變

基于7taa (PDB entry code)，利用同源建模軟件(SWISS-MODEL)構建米根霉α-淀粉酶3D模型，運用軟件Molegro Virtual Docker(MVD)對ROAmy與麥芽三糖底物進行分子對接，分析并選擇ROAmy結構中與麥芽三糖結合較為密切的氨基酸為待突變位點，設計引物并利用Overlapping PCR技術對待突變位點氨基酸進行突變。

1.4.2 突變體表達菌株的構建及發酵

以含有原始基因的重組質粒pUC57-ROAmy為模板，利用突變引物進行擴增，Overlapping PCR產物經EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切后與相同雙酶切處理的質粒pPIC9k相連接并導入E.coliJM109中，構建得到含有突變基因的重組質粒pPIC-rROAmy。抽提重組質粒pPIC-rROAmy并對突變基因進行序列測定，驗證正確后進一步使用SacI進行線性化并利用電轉化方法導入P.pastorisGS115。酵母轉化子經劃線分離純化后再利用含淀粉的篩選培養基進行培養，于30 ℃培養48 h后使用稀碘液進行染色，出現透明圈的菌落即為目標重組表達菌株。重組菌的搖瓶發酵方法及步驟按照畢赤酵母操作手冊[9]進行。

1.4.3 酶活測定

取1 mL可溶性淀粉(10 g/L)溶液與0.25 mL檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液(0.2 mol/L, pH 5.0)混合，50 ℃溫浴5 min后加入0.1 mL α-淀粉酶液，繼續保溫10 min后立即加入0.1 mL HCl溶液(0.1 mol/L)終止反應。使用DNS[10]法對反應液中的還原糖進行定量。以烘干至恒重的麥芽糖為標樣繪制DNS標準曲線。1個α-淀粉酶活力單位(U)定義為：在上述反應條件下，每分鐘生成1 mg麥芽糖所需要的酶量。

1.4.4 最適反應溫度及熱穩定性測定

在pH 5.0條件下，分別在25～75 ℃溫度下測定酶活力，以最高酶活力為100%計算相對酶活力確定酶的最適反應溫度；將酶液用pH 5.0緩沖液(檸檬酸-磷酸氫鈉0.2 mol/L)稀釋后，分別在40～70 ℃溫度下保溫0～20 min，保溫一定時間后立即取出樣品，冰上放置30 min后對酶活力進行檢測，以最高酶活力為100%計算相對酶活力以研究酶的熱穩定性。

1.4.5 最適反應pH測定

在55 ℃條件下分別使用不同pH(3.0～8.0)緩沖液進行酶活力測定，以最高酶活力為100%計算相對酶活力以確定酶的最適反應pH。

1.4.6 酶作用底物終產物分析

使用pH 5.0的檸檬酸-磷酸氫鈉緩沖液分別配置10 mg/mL的可溶性淀粉溶液與40 mmol/L的麥芽三糖溶液，在1.8 mL的溶液中加入0.2 mL酶液(10 U)，并在40 ℃下反應8 h，酶反應產物使用等體積三氯乙酸(100 g/L)終止反應，4 ℃靜置沉淀3 h后于7 000 r/min離心30 min，取上清液用0.2 μm微孔濾膜過濾，濾液中糖組分及含量HPLC法進行定量分析。HPLC檢測條件：色譜柱為Luna-NH2，流動相為甲醇+水(10+90,v/v)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為285 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2 結果與分析

2.1淀粉酶的底物分子對接和定點突變

研究報道發現，真菌α-淀粉酶的高麥芽糖形成能力可能與該淀粉酶水解麥芽三糖的能力有關，如與麥芽三糖親和常數的高低和低濃度麥芽三糖濃度下能夠發生的轉糖基化作用等[7-8]。因此，本研究選擇麥芽三糖(SID:22394327)為底物配體與ROAmy進行分子對接。由于不同編號的麥芽三糖分子在計算機模擬結構上的差異，在進行生物信息學模擬時會引起對接結結果的不同，因此研究中只能先預設一個特定編號的底物進行對接。在本研究中使用該編號底物進行對接時，發現與麥芽三糖底物可形成氫鍵相互作用的氨基酸殘基有Y80、H286和R333三個位點(如圖1所示)，該3個位點氨基酸殘基雖然在一級結構上距離較遠，但在三級結構中距離較近，均處于該淀粉酶的催化區域(Domain A)內。其中，Y80、H286和R333其與麥芽三糖的親和力分別為：-1.613 1 kJ/mol、-1.545 3 kJ/mol和-1.361 2 kJ/mol。由于可能影響酶水解特性的氨基酸多為結合位點氨基酸[2, 11]，因此研究中初步選擇以Y80、H286和R333三個位點氨基酸為待突變位點。

a-ROAmy; b-Y80; c-R333; d-H286; e-YHR; f-L286圖1 ROAmy及其突變體與麥芽三糖對接結果Fig.1 Docking results of maltotriose with ROAmy and its mutants

研究中以亮氨酸(L)為替換氨基酸，設計引物對上述3個位點氨基酸進行單位點突變和組合突變，分別獲得突變體Y80L、H286L、R333L和YHR(3個待突變氨基酸全部突變為亮氨酸)。同時，將4個突變體分別與麥芽三糖進行對接模擬(如圖1所示)，結果顯示突變體YHR與麥芽三糖對接后，突變體中僅有L286與麥芽三糖有相互作用，且與麥芽三糖的親和力降低為-2.117 6 kJ/mol，而突變后的L80與L333與麥芽三糖之間沒有發現相互氫鍵作用(結果未顯示)。

2.2ROAmy及其突變體最適作用溫度研究

在不同溫度下測定原酶ROAmy及其突變體的酶活力并計算相對值，發現單突變體中H286L最適作用溫度為55 ℃，較原酶提高了5 ℃，組合突變體YHR最適作用溫度為60 ℃，較原酶提高了10 ℃；突變體YHR在65 ℃和70 ℃時相對酶活力分別為最適溫度(60 ℃)下的91.1%和42.1%；H286L在65 ℃和70 ℃時的酶活力為最適溫度(55 ℃)下的64.5%和23.1%(如圖2所示)。其他2個單突變體Y80L和R333L的最適作用溫度與原酶相同(其數據可參考ROAmy)。通過單突變體與組合突變體的最適作用溫度比較可以發現，雖然單突變Y80L和R333L的最適作用溫度與原酶相同，但通過與H286L突變進行組合后會進一步提高單突變體H286L最適作用溫度。

圖2 溫度對ROAmy及其突變體YHR和H286L催化活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the catalytic activities of ROAmy, YHR and H286L

2.3ROAmy及其突變體溫度穩定性研究

將原酶ROAmy及其突變體在不同溫度下保溫20 min后，測定殘留酶活力，通過比較發現在40 ℃、60 ℃和70 ℃條件下突變體YHR與原酶的熱穩定性在總體趨勢上差異不明顯；在50 ℃條件下2者具有明顯差異，如原酶在該溫度下保溫20 min后酶活殘留為72.8%(圖3)，而突變體YHR殘留酶活僅為61.2%(圖4)。另，突變體H286L的熱穩定性趨勢與突變體YHR相似，而突變體Y80L和R333L的熱穩定性趨勢與原酶相近(其數據可參考ROAmy)。突變體YHR和H286L在最適催化溫度方面較原酶均有所提升，但是2者的熱穩性卻有所下降，表明雖然本研究中引入的氨基酸殘基變化可提高突變體在更高溫度下的催化速率，但同時也在一定程度上破壞了原始酶蛋白結構的穩定性。

圖3 溫度對ROAmy穩定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the stability of ROAmy

圖4 溫度對突變體YHR穩定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the stability of YHB

2.4ROAmy及突變體最適作用pH研究

實驗數據表明突變體YHR比原酶(ROAmy)的最適作用pH均為5.5，在其他pH范圍內催化速率的總體趨勢較為相似(圖5)，而突變體H286L的最適作用pH為5.0，比原酶減低了0.5，且總體pH作用條件向酸性范圍內偏移；突變體Y80L和R333L的最適作用pH與原酶相近(其數據可參考ROAmy)。與研究預期不同的是，雖然組合突變體YHR以及單突變體Y80L和R333L的pH作用條件與原酶相似，但是突變體H286L的最適作用pH卻明顯發生了偏移。

圖5 pH對ROAmy及其突變體YHR和H286L催化活力的影響Fig.5 Effect of pH on the catalytic activities of ROAmy, YHR and H286L

2.5ROAmy及突變體作用麥芽三糖終產物分析

以相同濃度的麥芽三糖為底物，加入酶活相同的ROAmy、YHR、Y80L、H286L和R333L于40 ℃、pH 5.0條件下反應8 h后對形成的終產物進行分析可知：與原酶相比，突變體YHR和H286L的作用產物中麥芽糖含量分別提高了18.87%和16.87%(如表1所示)，相應的底物殘留變少；突變體Y80L的產物中底物殘留較多，相應的產物葡萄糖和麥芽糖濃度略有降低；突變體R333L的產物中各組分濃度與原酶相當。上述數據顯示突變體YHR和H286L對底物麥芽三糖的轉化率得到了提升，而突變體Y80L對底物的轉化率卻有所下降，表明該蛋白中H286和Y80兩個位點的氨基酸殘基可能與該酶的高麥芽糖性能能力有關。另，需要指出的是，H286的突變(L)對底物轉化能力具有提升作用，而Y80的突變(L)則會引起轉化率降低，然而兩者卻在組合突變體YHR中表現出了一定的正向疊加效應。

表1 ROAmy及其突變體水解麥芽三糖終產物比較

注：G1-G6分別表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽六糖。

2.6 ROAmy及突變體作用淀粉酶終產物分析

在以麥芽三糖為底物研究的基礎上，為進一步分析各突變體在淀粉水解過程中的差異，研究中以相同濃度的可溶性淀粉為底物，加入相同酶活力的ROAmy、YHR、Y80L、H286L和R333L于40 ℃、pH 5.0條件下反應8 h后可以發現，突變體YHR作用產物中麥芽糖的濃度最高，其次為突變體H286L，與原酶相比分別提高了11.67%和10.32%(如表2所示)；突變體Y80L的作用產物中麥芽糖濃度與原酶相近，而突變R333L的作用產物中麥芽糖濃度略低于原酶。同時可以發現，突變體Y80L的作用產物中葡萄糖的量減少，麥芽三糖和麥芽四糖的濃度上升。上述數據表明，研究中所選擇的3個位點氨基酸殘基的變化對該酶作用淀粉終產物中糖組分含量均有不同程度的影響，其影響的規律與以麥芽三糖為底物獲得數據相似，表明該淀粉酶對麥芽三糖轉化能力的變化可直接影響水解淀粉生成麥芽糖的效率。

表2 ROAmy及其突變體水解可溶性終產物比較

注：G1-G6分別表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽六糖。

3 討論

在工業應用過程中，真菌α-淀粉酶與細菌α-淀粉酶在水解淀粉的過程中最顯著的區別是真菌α-淀粉酶的作用產物中以麥芽糖為主，因此真菌α-淀粉酶有時又被稱為糖化型淀粉酶。然而針對真菌α-淀粉酶為什么具有高麥芽糖形成能力這一問題一直沒有得到明確的解釋，有關真菌α-淀粉酶蛋白質結構及其高麥芽糖形成能力之間的關系研究在國內外相關研究領域中尚處于空白階段。為此，本文以探索真菌α-淀粉酶蛋白質結構與高麥芽糖形成能力之間的關系為目的，以麥芽三糖為底物配體，通過生物信息學輔助分析對米根霉α-淀粉酶進行了分子對接模型構建，確定了3個可能與該淀粉酶高麥芽糖生成能力相關的氨基酸并利用定點突變技術獲得了相應的單突變體和組合突變體，同時對突變體的理化性質和作用產物進行了分析。研究中發現Y74和H286兩個殘基的變化對該酶以麥芽三糖和淀粉為底物形成麥芽糖的能力均有影響，且對麥芽三糖的作用規律與對淀粉的作用規律相似，表明真菌α-淀粉酶的麥芽糖生成能力與其對麥芽三糖的水解能力關系較為密切，這與其他部分有關該類酶的性質研究報道相符[7, 12]。

研究中初步獲得了與米根霉α-淀粉酶麥芽糖生成能力相關的部分氨基酸，并使突變體的作用產物中麥芽糖含量得到明顯提升，結果可為真菌α-淀粉酶高麥芽糖形成機制以及高麥芽糖形成能力的定向進化研究提供一定的理論和方法方面的參考。同時，蛋白質結構與功能關系研究是一個長期而無止境的過程，本研究中只初步選擇了3個氨基酸殘基進行單突變和組合突變研究，所獲得的數據尚不完整。因此，在以后的工作將選取更多的氨基酸殘基進行單突變或定點飽和突變，以綜合比較各突變體性能并進一步解釋本研究中無法解答的一些實驗現象，以期更為詳細的解析真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關的關鍵氨基酸或蛋白質結構。

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Preliminaryanalysisofthekeyaminoacidsrelatedtothehighmaltose-formingabilityofRhizopusoryzaeα-amylase

TIAN Fang-yuan1，TANG Bin1,2*，LI Song1,2，YANG Qian1

1(School of Biological and Chemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, China) 2(Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation, Wuhu 241000, China)

In this study, the computer-assisted simulation technique was used to perform molecular docking forRhizopusoryzaeα-amylase with maltotriose. The amino acid residues related to high maltose-forming ability of the enzyme were selected and mutated. The results showed that the optimum temperature of the mutants YHR and H286L was 10 ℃ and 5 ℃ higher than that of the native enzyme (50 ℃), respectively, and the optimum pH of the mutant H286L decreased by 0.5. Compared with the native enzyme, the content of maltose in the end-products formed from maltotriose by the mutants YHR and H286L increased by 18.87% and 16.87%, respectively, and the content of maltose in the end-products formed from soluble starch was increased by 11.67% and 10.32%, respectively. The results showed that the relationship between H286 and the high maltose production capacity of the enzyme was the closest, and followed by Y80 and R333.

fungal α-amylase; maltose; protein structure; site-directed mutation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014278

碩士研究生(湯斌教授為通訊作者,E-mail:tangbin@ahpu.edu.cn)。

國家自然科學基金青年項目(31401630)

2017-03-11，改回日期：2017-05-05