乳酸菌生物學(xué)特性與其拮抗空腸彎曲桿菌在小鼠腸道定植能力的分析

王剛，賀禹豐，陳曉華，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)，421008)

乳酸菌生物學(xué)特性與其拮抗空腸彎曲桿菌在小鼠腸道定植能力的分析

王剛1*，賀禹豐1，陳曉華2，趙建新1，張灝1，陳衛(wèi)1

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)，421008)

采用3周齡C57BL/6小鼠建立了空腸彎曲桿菌感染模型，評(píng)價(jià)了8株在體外具有抑制空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)能力的乳酸菌在體內(nèi)拮抗空腸彎曲桿菌定植的能力，同時(shí)對(duì)該8株菌生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附能力等生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定，通過主成分分析對(duì)8株乳酸菌生物學(xué)特性的評(píng)價(jià)以及皮爾森相關(guān)性系數(shù)對(duì)乳酸菌生物學(xué)特性及其在體內(nèi)拮抗空腸彎曲桿菌定植能力相關(guān)性的分析，發(fā)現(xiàn)8株乳酸菌種間生物學(xué)特性差異明顯大于種內(nèi)生物學(xué)特性差異，且乳酸菌在小鼠體內(nèi)拮抗空腸彎曲桿菌定植的能力與其細(xì)胞黏附能力呈正相關(guān)。具有最高黏附指數(shù)的植物乳桿菌N8、N9可有效清除模型小鼠腸道內(nèi)的空腸彎曲桿菌，對(duì)保護(hù)人體免受空腸彎曲桿菌感染具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也為具有拮抗致病菌能力的益生菌的篩選提供了理論依據(jù)。

乳酸菌；空腸彎曲桿菌；拮抗；黏附；小鼠感染模型

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni，C.jejuni)是一種革蘭氏陰性病原菌。20世紀(jì)90年代以來，C.jejuni感染率上升明顯，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，該菌是造成腹瀉的主要病原體之一[1]。人體感染C.jejuni可造成腹痛、水樣腹瀉以及便血，嚴(yán)重時(shí)甚至可能引起格林-巴利綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)，導(dǎo)致急性神經(jīng)麻痹[2]。目前，抗生素是治療C.jejuni感染的常用療法，然而C.jejuni抗藥性的與日俱增促使人們尋找可替代抗生素治療的新方法[3]。

部分乳酸菌是健康人類腸道中的固有菌群，其對(duì)于維持人體腸道健康發(fā)揮著十分重要的作用。研究表明，乳酸菌對(duì)多種病原菌具有良好的抑制作用，如沙門氏菌[4]、大腸桿菌O157:H7[5]、單增李斯特菌[6]等。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對(duì)于防治C.jejuni感染同樣具有良好的效果。CEAN[7]等篩選得到了4株可以阻止C.jejuni入侵雞原代細(xì)胞的乳酸菌，將4株菌混合后喂食給幼年和成年肉雞，均可顯著降低其腸道內(nèi)C.jejuni定植量。SANTINI[8]等的研究表明，BifidobacteriumlongumPCB 133可以在體外有效抑制C.jejuni生長(zhǎng)，同時(shí)具有良好的加工性能以及消化道耐受能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該菌可在雞體內(nèi)有效定植6天以上，并能夠顯著降低C.jejuni定植量。

本研究通過建立C.jejuni在小鼠體內(nèi)定植模型并利用該模型評(píng)價(jià)乳酸菌對(duì)C.jejuni在體內(nèi)定植的拮抗能力，同時(shí)將拮抗能力與乳酸菌的部分生物學(xué)特性進(jìn)行相關(guān)性分析，探索乳酸菌拮抗C.jejuni感染定植的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞株

本研究選用實(shí)驗(yàn)室保藏的已知對(duì)C.jejuni具有體外抑制作用的8株乳酸菌。8株乳酸菌以及C.jejuniNCTC11168均保藏于實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)并經(jīng)過16s rDNA測(cè)序確定種屬。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。8株乳酸菌的編號(hào)、種屬見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用乳酸菌菌株信息

1.2試劑與儀器

腦心浸液肉湯(BHI)，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌綿羊血，購(gòu)自杭州新銳生物工程有限公司；Skirrow空彎選擇性混合抗生素，購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

BD150L三氣培養(yǎng)箱，德國(guó)Bingd公司；PYX-DHS隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；生物安全柜，美國(guó)Labconco公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 GC-MS-QP2010 Ulra System，日本島津公司。

1.3菌株的培養(yǎng)

乳酸菌菌株以30%甘油凍存于-80 ℃超低溫冰箱中，使用時(shí)先于4 ℃下化凍并以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h，以此條件活化2代備用。

C.jejuni菌株以30%甘油凍存于-80 ℃超低溫冰箱中，使用時(shí)先于4 ℃下化凍并在哥倫比亞血平板上劃線接種，于37 ℃三氣培養(yǎng)箱(5% O2, 10% CO2,85% N2)培養(yǎng)48 h后備用。

1.4空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取哥倫比亞血平板上的C.jejuni單菌落并接種于BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于新鮮BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)，間隔不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。

1.5牛津杯法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌效果

實(shí)驗(yàn)方法參考張婷婷[9]等的方法并加以改良：將37 ℃培養(yǎng)20 h后的乳酸菌懸液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾后得到乳酸菌發(fā)酵上清液。取部分上清液，用NaOH將其pH值調(diào)整為6.5。取100 μL 1×106CFU/mL的C.jejuni菌懸液，均勻涂布于哥倫比亞血平板上，將無(wú)菌牛津杯插入平板瓊脂層并避免插至平板底部。取200 μL乳酸菌發(fā)酵上清液沿壁加入牛津杯中，蓋上平板蓋并將平板正置于三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察并測(cè)量牛津杯外圍抑菌圈直徑。每個(gè)樣本做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，以MRS培養(yǎng)基(pH=6.5)作為陰性對(duì)照，0.28 mg/mL的諾氟沙星溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6乳酸菌生物學(xué)特性的評(píng)價(jià)

1.6.1 生長(zhǎng)速率

取活化后的乳酸菌，調(diào)整至相同活菌數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)20 h后進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。將此時(shí)的乳酸菌活菌數(shù)用于評(píng)估其生長(zhǎng)速率。

1.6.2 產(chǎn)酸能力

取活化后的乳酸菌，調(diào)整至相同活菌數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)20 h后用0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾，得到無(wú)菌發(fā)酵上清液并用pH計(jì)測(cè)量，每株菌做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 生物膜形成能力

取活化后的乳酸菌，調(diào)整至相同活菌數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)1∶100的比例稀釋于MRS培養(yǎng)基中，混勻。移取200 μL菌懸液至96孔板中，37 ℃培養(yǎng)48 h。吸走孔中懸浮菌液，用200 μL PBS緩沖液輕柔地沖洗2次，恒溫干燥箱中烘干剩余水分。用200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色20 min，繼續(xù)以200 μL PBS緩沖液輕柔地沖洗3次，烘干。每孔加入200 μL 95%乙醇，震蕩3 min后，移取150 μL孔中液體至新的96孔板中，在595 nm處測(cè)量吸收值。

1.6.4 黏附HT-29細(xì)胞能力

實(shí)驗(yàn)方法參考王剛[10]的方法等并稍作修改：以RPMI-1640完全培養(yǎng)基復(fù)蘇凍存于液氮的HT-29細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下靜置培養(yǎng)，每2天換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%密度，用胰酶消化并進(jìn)行傳代，直至細(xì)胞生長(zhǎng)到足夠數(shù)量。將貼壁生長(zhǎng)的HT-29細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以RPMI-1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL。向24孔板中加入1 mL HT-29細(xì)胞懸液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至貼壁狀態(tài)后吸去培養(yǎng)液，并用PBS緩沖液沖洗2次，加入1 mL乳酸菌懸液(以RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，1×108CFU/mL)，并補(bǔ)加RPMI-1640培養(yǎng)基(不含血清及抗生素)至2 mL，37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h。孵育結(jié)束后用PBS緩沖液清洗3次，以除去未黏附的細(xì)菌，用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞表面黏附的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過計(jì)算得出乳酸菌的黏附指數(shù)(每個(gè)細(xì)胞表面平均黏附的細(xì)菌個(gè)數(shù))。

1.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.7.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用3周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，同室分籠喂養(yǎng)，每籠6只。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20±2) ℃，濕度(60±5)%，12 h光照12 h黑暗，每3～4 d更換墊料。每日灌胃體積為200 μL/只，C.jejuni灌胃菌數(shù)為2×109CFU/mL，不同乳酸菌灌胃菌數(shù)統(tǒng)一調(diào)整為5×109CFU/mL。飼養(yǎng)過程中每周稱量小鼠體重。實(shí)驗(yàn)分組及處理方案詳見表2。

表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理方案

1.7.2 小鼠糞便中C.jejuni的計(jì)數(shù)

收集動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)第28天的糞便，置于4 ℃冰盒中。將0.1 g糞便重懸于PBS緩沖液中，充分混勻后進(jìn)行梯度稀釋并涂布于哥倫比亞血平板，三氣條件下培養(yǎng)48 h后對(duì)C.jejuni菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。哥倫比亞血平板配制時(shí)以體積分?jǐn)?shù)1∶250的比例加入Skirrow混合抗生素，用于抑制雜菌生長(zhǎng)。

1.7.3 小鼠糞便中短鏈脂肪酸的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法參考毛丙永[11]等并略作改動(dòng)：準(zhǔn)確稱取50 mg糞便置于EP管中，加入500 mL飽和NaCl溶液，浸泡30 min，破碎至無(wú)明顯顆粒狀。加入20 μL硫酸酸化，漩渦振蕩30 s，準(zhǔn)確加入800 μL乙醚用于萃取短鏈脂肪酸，漩渦振蕩30 s后14 000 r/min離心15 min。吸取全部上清，向上清中加入0.25 g無(wú)水硫酸鈉，14 000 r/min離心15 min，將液相移入進(jìn)樣瓶中上機(jī)分析。

GC-MS采用Rtx-Wax柱，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 μm；載氣為He，流速2 mL/min；進(jìn)樣體積1 μL，分流比10∶1；進(jìn)樣溫度設(shè)定為240 ℃，按如下程序進(jìn)行升溫：初始溫度為100 ℃，按7.5 ℃/min升溫至140 ℃，之后按照60 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min，離子化溫度為220 ℃；分析采用全掃描模式，用外標(biāo)法計(jì)算乙酸、丙酸、丁酸的濃度(μmol/g)。

1.8數(shù)據(jù)處理及分析

本研究數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)使用EXCEL 2010及SPSS 20.0進(jìn)行處理，利用單因素方差分析(ANOVA)兩兩比較中的Tukey s-b法進(jìn)行顯著性分析，p<0.05則認(rèn)為存在顯著性差異，利用皮爾森相關(guān)系數(shù)法 (Pearson correlation coefficient)進(jìn)行相關(guān)性分析，利用主成分分析法(Principal component analysis ，PCA)進(jìn)行多組數(shù)據(jù)主成分分析。

2 結(jié)果

2.1空腸彎曲桿菌的生長(zhǎng)曲線

了解C.jejuni的生長(zhǎng)曲線有助于獲得更高數(shù)量級(jí)、更強(qiáng)活力的菌體，從而用于后續(xù)的感染研究。由圖1可知，C.jejuniNCTC11168可以在BHI培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)，接種后0～18 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，42 h后進(jìn)入衰亡期，菌體量最高可達(dá)到2×109CFU/mL。因此選用接種24 h后處于穩(wěn)定期的C.jejuni用于后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)，以確保足夠的菌體量以及菌體活力。

圖1 C.jejuni在BHI培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of C.jejuni in BHI broth

2.2乳酸菌在體外可抑制C.jejuni的生長(zhǎng)

本研究利用牛津杯法測(cè)定了8株乳酸菌發(fā)酵上清液(未經(jīng)pH調(diào)整)體外抑制C.jejuni生長(zhǎng)的能力，結(jié)果見圖2。可以看出，8株乳酸菌的發(fā)酵上清液均對(duì)C.jejuni生長(zhǎng)均具有明顯的抑制作用，菌株N29抑菌圈直徑超過13 mm，而其他菌株均超過15 mm。諾氟沙星陽(yáng)性對(duì)照組平板上幾乎未見C.jejuni生長(zhǎng)，故未測(cè)量抑菌圈直徑。8株乳酸菌的抑菌圈直徑與空白對(duì)照組MRS相比，均存在顯著性差異(p<0.05)。而將8株乳酸菌發(fā)酵上清液pH值調(diào)為6.5后，抑菌圈直徑與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，證明乳酸菌在體外抑制C.jejuni的生長(zhǎng)的主要物質(zhì)是代謝產(chǎn)物中的有機(jī)酸或pH依賴的抑菌成分。

圖2 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)C.jejuni生長(zhǎng)的抑制作用Fig.2 C.jejuni growth was inhibited by cell-free supernatants of Lactobacillus strains

2.3乳酸菌在小鼠體內(nèi)對(duì)C.jejuni感染的拮抗作用

2.3.1 乳酸菌降低C.jejuni在小鼠體內(nèi)的定植數(shù)

圖3 小鼠糞便中C.jejuni活菌數(shù)Fig.3 Viable cells of C.jejuniin mice feces

通過對(duì)小鼠糞便中C.jejuni活菌進(jìn)行平板涂布計(jì)數(shù)，反映C.jejuni在小鼠體內(nèi)的定植情況。由圖3可知，C.jejuni感染組28天糞便中仍能檢測(cè)到超過1.9×105CFU/g 的C.jejuni活菌，說明C.jejuni在3周齡小鼠腸道內(nèi)能夠有效定植。而L.plantarumN8、N9處理組的小鼠糞便中未能檢出C.jejuni活菌，L.plantarumN34、B、Rui處理組小鼠糞便中C.jejuni活菌相比C.jejuni感染組降低了近1個(gè)數(shù)量級(jí)，L.rhamnosusZX6、ZX7、L.fermentiumN29處理組C.jejuni活菌數(shù)相比C.jejuni感染組無(wú)顯著差異(p>0.05)。以上結(jié)果表明L.plantarumN8、N9在模型小鼠體內(nèi)能有效降低C.jejuni的定植率。

2.3.2 小鼠體重變化

從飼養(yǎng)第1天起每周測(cè)量各組小鼠體重以觀察體重變化。由表3可以看出，用于實(shí)驗(yàn)的3周齡小鼠初始體重不足10 g，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程體重逐步增加。C.jejuni感染以及不同乳酸菌處理并未對(duì)小鼠體重變化產(chǎn)生顯著性影響(p>0.05)。

表3 小鼠體重變化

注：各組之間數(shù)據(jù)均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

2.4乳酸菌生物學(xué)特性與其體內(nèi)拮抗C.jejuni定植的相關(guān)性

不同乳酸菌菌株具有各自的生理學(xué)特性，其益生功效與菌株自身生物學(xué)特性密切相關(guān)。部分研究表明[12-14]，乳酸菌的生長(zhǎng)速率、對(duì)細(xì)胞的黏附能力以及生物膜形成能力可能對(duì)乳酸菌在體內(nèi)的定植起到了重要的影響。而乳酸菌的產(chǎn)酸能力則決定了其在腸道內(nèi)拮抗病原菌的能力[15]。因此本研究進(jìn)一步探究了以上具有體外拮抗C.jejuni生長(zhǎng)能力的乳酸菌在生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附能力等方面的差異，并通過主成分分析及相關(guān)性分析確定不同乳酸菌在各生物學(xué)特性方面的表現(xiàn)以及與其體內(nèi)拮抗C.jejuni定植的相關(guān)性。

2.4.1 乳酸菌的生長(zhǎng)速率

按照1.6.1所述方法對(duì)8株乳酸菌生長(zhǎng)速率進(jìn)行測(cè)定。從圖4可以看出，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，除N29外其余7株菌的活菌數(shù)均可超過1×109CFU/mL，其中Rui、ZX7生長(zhǎng)速率最快，可超過3×109CFU/mL，N29生長(zhǎng)速率最慢，僅為7×108CFU/mL。不同菌株生長(zhǎng)速率的種間、種內(nèi)差異均比較明顯(p<0.05)。

圖4 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率Fig.4 Growth rate of Lactobacillus strains in MRS broth

2.4.2 乳酸菌產(chǎn)酸能力

對(duì)8株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h的發(fā)酵上清液pH值進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表4。N8、N9、N34、B、Rui、ZX6、ZX7均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵上清液pH在3.80～3.90之間，菌株之間差異不明顯(p>0.05)。而N29產(chǎn)酸能力較弱，發(fā)酵上清液pH僅為4.38。

表4 乳酸菌發(fā)酵上清液pH值

2.4.3 乳酸菌生物膜形成能力

按照1.6.3所述方法測(cè)定了8株乳酸菌自身形成生物膜的能力，OD595數(shù)值代表了生物膜形成量。由圖5可知，不同菌株生物膜形成能力差異明顯，其中N9、N34、Rui、N29自身成膜能力較強(qiáng)，N8、B、ZX6成膜能力一般，ZX7幾乎不具備生物膜形成能力。

圖5 乳酸菌自身生物膜形成能力Fig.5 Biofilm formation of Lactobacillus strains

2.4.4 乳酸菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力

按照1.6.4所述方法評(píng)價(jià)了8株乳酸菌體外黏附HT-29細(xì)胞的能力，結(jié)果如圖6所示。其中N8、N9粘附能力最為出色，B、Rui也具備一定黏附能力，而N34、ZX6、ZX7、N29黏附能力較差。從8株菌的種屬來看，L.plantarum的黏附能力普遍強(qiáng)于L.rhamnosus與L.fermentium且L.plantarum黏附能力的種內(nèi)差異也十分明顯。

圖6 乳酸菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力Fig.6 Adhesion of Lactobacillus strains to HT-29 cells

2.4.5 主成分分析8株乳酸菌的生物學(xué)特性分布規(guī)律

本研究采用主成分分析法對(duì)8株乳酸菌的生物學(xué)特性分布規(guī)律進(jìn)行了分析，得到第一主成分F1和第二主成分F2，分別包含了原來信息的51.34%和36.55%。第一主成分F1綜合了產(chǎn)酸、生長(zhǎng)2個(gè)特性，第二主成分F2綜合了生物膜、黏附2個(gè)特性，具體見圖7。由圖7可知，L.plantarumN8、N9、N34、B、Rui集中于第一象限附近，距離4種生物學(xué)特性坐標(biāo)點(diǎn)距離較近。這說明5株L.plantarum在4項(xiàng)生物學(xué)特性的評(píng)估中均有不錯(cuò)的表現(xiàn)，N8、N9、Rui尤為突出。而L.rhamnosusZX6、ZX7、L.fermentiumN29距離4種生物學(xué)特性坐標(biāo)點(diǎn)較遠(yuǎn)，說明其在生物學(xué)特性的評(píng)價(jià)中表現(xiàn)較差。此外，同一菌種在圖中分布相對(duì)集中，這說明8株乳酸菌的生物學(xué)特性種間差異大于種內(nèi)差異。

圖7 8株乳酸菌生物學(xué)特性PCA分布Fig.7 PCA analysis of characteristics of 8 Lactobacillus strains

2.4.6 皮爾森相關(guān)性系數(shù)法分析

皮爾森相關(guān)系數(shù)法是一種準(zhǔn)確度量2個(gè)變量關(guān)系之間密切程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，其相關(guān)性系數(shù)r值位于-1和1之間[16]。本研究分析了乳酸菌降低C.jejuni在小鼠體內(nèi)定植的能力與8株乳酸菌生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附HT-29細(xì)胞能力的皮爾森相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表5。可以看出糞便中C.jejuni活菌數(shù)與乳酸菌的黏附細(xì)胞的能力具有極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，這說明8株乳酸菌中，黏附能力越強(qiáng)的菌株對(duì)小鼠體內(nèi)C.jejuni定植的拮抗效果越好。而乳酸菌降低C.jejuni在小鼠體內(nèi)定植的能力與其生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力等生物學(xué)特性未見有顯著的相關(guān)性。

表5 皮爾森相關(guān)性系數(shù)法分析

2.5具有顯著拮抗C.jejuni定植能力的乳酸菌對(duì)小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

本研究進(jìn)一步選取在小鼠體內(nèi)拮抗C.jejuni定植能力出色的L.plantarumN8，測(cè)定了該處理組小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸的含量，結(jié)果如圖8。可見C.jejuni的感染本身并不會(huì)明顯影響小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸的含量 (p>0.05)，而L.plantarumN8攝入則可使小鼠糞便中乙酸含量顯著增加(p<0.05)。這說明L.plantarumN8對(duì)C.jejuni的清除能力可能與其在腸道內(nèi)的定植及產(chǎn)酸具有密切的聯(lián)系。

圖8 小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量Fig.8 Acetic acid , propionic acid , butyric acid in mice feces

3 討論

空腸彎曲桿菌依然是威脅人類腸道健康的主要病原菌之一[17]。近年來，利用大環(huán)內(nèi)脂類或喹諾酮藥物治療C.jejuni感染受到了越來越多的質(zhì)疑[18]。因此，開發(fā)可以替代抗生素有效預(yù)防和治療C.jejuni感染的新方法變得十分重要。乳酸菌作為腸道中的常見菌種，其對(duì)病原菌感染的保護(hù)作用正逐步引起人們的重視。雖然禽類作為模型用于評(píng)價(jià)乳酸菌拮抗C.jejuni感染已獲得較為廣泛的應(yīng)用[19-20]，但該模型并不完全適合用于模擬人類感染C.jejuni的病理過程。小鼠感染模型經(jīng)常被用于模擬多種致病菌的感染過程[21-22]，但是成年小鼠由于其成熟的腸道菌群產(chǎn)生“定植抗性”，導(dǎo)致C.jejuni無(wú)法有效在小鼠體內(nèi)定植[23]。有研究表明3周齡的斷奶小鼠對(duì)C.jejuni更為易感，可使C.jejuni在小鼠體內(nèi)以一定數(shù)量有效定植[24]。本研究中C.jejuni可在3周齡小鼠腸道內(nèi)以超過105數(shù)量級(jí)定植且乳酸菌可有效減少腸道中C.jejuni活菌數(shù)，說明該小鼠模型可用于評(píng)價(jià)乳酸菌在體內(nèi)拮抗C.jejuni定植的能力。然而本研究中C.jejuni的定植尚未對(duì)小鼠體重產(chǎn)生明顯影響，這在一定程度上說明該模型尚不足以模擬嚴(yán)重的人體感染C.jejuni的病理狀態(tài)。

本研究使用的8株乳酸菌通過牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)其發(fā)酵上清液均可在體外有效抑制C.jejuni的生長(zhǎng)，且8株乳酸菌對(duì)C.jejuni的體外拮抗能力受發(fā)酵液pH影響顯著，這與金星[25]探究乳酸菌體外抑菌成分的結(jié)果一致，表明乳酸菌體外拮抗C.jejuni能力主要與其產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)。雖然這些乳酸菌在體外拮抗C.jejuni生長(zhǎng)的能力差異并不明顯，但在小鼠感染模型中卻表現(xiàn)出對(duì)C.jejuni定植非常明顯的差異。由于體外拮抗實(shí)驗(yàn)僅僅反映了發(fā)酵上清對(duì)C.jejuni生長(zhǎng)的抑制作用，而體內(nèi)拮抗實(shí)驗(yàn)則會(huì)受到乳酸菌在腸道內(nèi)的定植及抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生等一系列因素的影響。因此導(dǎo)致乳酸菌在體內(nèi)具有不同拮抗能力的原因可能與乳酸菌的部分生物學(xué)特性有關(guān)。例如，研究認(rèn)為有機(jī)酸是乳酸菌用以拮抗病原微生物的主要物質(zhì)之一[26]；而黏附是乳酸菌與宿主作用的第一步，是其在宿主體內(nèi)發(fā)揮益生功能的基礎(chǔ)[27]；乳酸菌的表面疏水性、自聚集能力和產(chǎn)胞外多糖能力可能影響其自身成膜能力[28]，乳酸菌可在特定環(huán)境下形成生物膜，形成生物膜的乳酸菌具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和抗逆性[29]，有利于其在腸道內(nèi)發(fā)揮益生功效。因此，乳酸菌的生長(zhǎng)速率、對(duì)細(xì)胞的黏附能力以及生物膜形成能力可能對(duì)乳酸菌在體內(nèi)的定植起到了重要的影響，而乳酸菌的產(chǎn)酸能力則決定了其在腸道內(nèi)拮抗病原菌的能力。

本研究評(píng)估了8株乳酸菌在生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附能力等方面的生物學(xué)特性差異。8株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中均可以較快生長(zhǎng)，除L.fermentiumN29外，其余菌株培養(yǎng)20 h后均超過109CFU/mL；在產(chǎn)酸能力方面，除L.fermentiumN29的7株乳酸菌均有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力；而8株乳酸菌生物膜形成能力各異，無(wú)明顯種間或種內(nèi)差異；對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力，8株乳酸菌表現(xiàn)出一定的差異，總體來看植物乳桿菌黏附能力較鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌更強(qiáng)，這與LIN[30]等研究結(jié)論一致。此外，乳酸菌的黏附能力往往也表現(xiàn)出明顯的種內(nèi)差異，本研究中5株植物乳桿菌黏附能力差異明顯，這在趙煜[31]、MORITA[32]等人的研究中也有充分體現(xiàn)。

不同乳酸菌在部分生物學(xué)特性方面表現(xiàn)出一定的差異，主成分分析結(jié)果表明，L.plantarumN8、N9、Rui相較之L.plantarumN34、B，L.rhamnosusZX6、ZX7和L.fermentiumN29具有更為出色的生物學(xué)特性，這與乳酸菌在小鼠模型中對(duì)C.jejuni定植率的影響是吻合的。而進(jìn)一步的皮爾森相關(guān)性分析表明8株乳酸菌在小鼠體內(nèi)拮抗C.jejuni能力與其黏附HT-29細(xì)胞能力呈極強(qiáng)正相關(guān)。這說明乳酸菌進(jìn)入宿主體內(nèi)后能否黏附于腸道上皮并順利增殖以完成定植，決定了乳酸菌對(duì)致病菌的拮抗效果。而對(duì)小鼠糞便中短鏈脂肪酸的分析表明，具有很好細(xì)胞黏附能力的L.plantarumN8會(huì)使小鼠腸道中乙酸含量增加，這表明該菌在攝入后的定植及產(chǎn)酸能夠顯著拮抗C.jejuni在小鼠腸道內(nèi)的定植。

綜上所述，8株乳酸菌中L.plantarumN8、N9能夠有效降低小鼠腸道中C.jejuni活菌數(shù)，其作為益生菌用于拮抗C.jejuni感染具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。相關(guān)性分析表明，8株乳酸菌的黏附能力與其在體內(nèi)拮抗C.jejuni定植能力呈強(qiáng)正相關(guān)，該結(jié)果為今后具有拮抗致病菌能力的益生菌的篩選提供了理論依據(jù)。

[1] DASTI J I, TAREEN A M, LUGERT R, et al.Campylobacterjejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms.[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2010, 300(4):205-211.

[2] ALTEKRUSE S F, STERN N J, FIELDS P I, et al.Campylobacterjejuni-an emerging foodborne pathogen.[J]. Emerging Infectious Diseases, 1999, 5(1):28-35.

[3] ALFREDSON D A, KOROLIK V. Antibiotic resistance and resistance mechanisms inCampylobacterjejuniandCampylobactercoli[J]. Fems Microbiology Letters, 2007, 277(2):123-132.

[4] CASTILLO N A, LEBLANC A D M D, GALDEANO C M, et al. Comparative study of the protective capacity againstSalmonella, infection between probiotic and nonprobioticlactobacilli[J]. Journal of Applied Microbiology, 2012, 114(3):861-876.

[5] GAGNON M, KHEADR E E, LE B G, et al.Invitroinhibition ofEscherichiacoliO157:H7 byBifidobacterialstrains of human origin[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 92(1):69-78.

[6] DE W R, GARSSEN J, BOKKEN G C, et al. Antagonistic activity ofLactobacilluscaseistrain shirota against gastrointestinalListeriamonocytogenesinfection in rats[J]. International Journal of Food Microbiology, 2002, 73(1):93-100.

[7] CEAN A, STEF L, SIMIZ E, et al. Effect of human isolated probiotic bacteria on preventingCampylobacterjejunicolonization of poultry[J]. Foodborne Pathogens & Disease, 2015, 12(2):122-130.

[8] SANTINI C, BAFFONI L, GAGGIA F, et al. Characterization of probiotic strains: an application as feed additives in poultry againstCampylobacterjejuni[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 141 Suppl 1(8):S98-S108.

[9] 張婷婷, 翟齊嘯, 金星,等. 具有拮抗空腸彎曲桿菌能力雞源乳酸菌的篩選及特性[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2017, 44(1):118-125.

[10] 王剛, 金星, 印伯星,等. 1株具有拮抗空腸彎曲桿菌作用的唾液乳桿菌的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14(12):6-12.

[11] 毛丙永. 功能性低聚糖對(duì)腸道細(xì)菌的影響及機(jī)制[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2015.

[12] 任鵬飛. 乳酸菌益生效應(yīng)評(píng)價(jià)體外模型建立及黏附相關(guān)機(jī)制研究[D]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013.

[13] 任真真. 以斑馬魚為模型篩選高黏附性乳酸菌及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究[D]. 杭州:浙江工商大學(xué), 2015.

[14] 任大勇. 益生乳酸桿菌的黏附及免疫調(diào)節(jié)作用研究[D]. 長(zhǎng)春:吉林大學(xué), 2013.

[15] 于卓騰. 雞腸黏膜乳酸菌的分離鑒定及其益生特性研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[16] 楊帆, 馮翔, 阮羚,等. 基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)法的水樹枝與超低頻介損的相關(guān)性研究[J]. 高壓電器, 2014,50(6):21-31.

[17] SALAHEEN S, NGUYEN C, HEWES D, et al. Cheap extraction of antibacterial compounds of berry pomace and their mode of action against the pathogenCampylobacterjejuni[J]. Food Control, 2014, 46:174-181.

[18] WANG G, ZHAO Y, TIAN F, et al. Screening of adhesive lactobacilli with antagonistic activity againstCampylobacterjejuni[J]. Food Control, 2014, 44(44):49-57.

[19] STERN N J, SVETOCH E A, ERUSLANOV B V, et al. Isolation of aLactobacillussalivariusstrain and purification of its bacteriocin, which is inhibitory toCampylobacterjejuniin the chicken gastrointestinal system[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2006, 50(9):3 111-3 116.

[20] COLE K, M B FARNELL, A M DONOGHUE, et al. BacteriocinsreduceCampylobactercolonizationand alter gut morphology in turkey poults[J]. Poultry Science, 2006, 85(9):1 570-1 575.

[21] AIBA Y, NAKANO Y, KOGA Y, et al. A highly acid‐resistant novel strain ofLactobacillusjohnsoniiNo. 1088 has antibacterial activity, including that againstHelicobacterpylori, and inhibits gastrin-mediated acid production in mice[J]. Microbiologyopen, 2015, 4(3):465-474.

[23] HAAG L M, FISCHER A, OTTO B, et al.Campylobacterjejuniinfection of infant mice: acuteenterocolitis is followed by asymptomatic intestinal and extra-intestinal immuneresponses[J]. European Journal of Microbiology & Immunology, 2012, 2(1):2-11.

[24] LEA MH, ANDRé F, BETTINA O, et al. Intestinal microbiotashifts towards elevated commensalEscherichiacoliloads abrogate colonization resistance againstCampylobacterjejuniin mice[J]. Plos One, 2012, 7(5):e35988.

[25] 金星. 具有拮抗空腸彎曲桿菌效應(yīng)的乳酸菌的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2014.

[26] MAKRAS L, TRIANTAFYLLOU V, FAYOLMESSAOUDI D, et al. Kinetic analysis of the antibacterial activity of probiotic lactobacilli towardsSalmonellaentericaserovarTyphimurium reveals a role for lactic acid and other inhibitory compounds[J]. Research in Microbiology, 2006, 157(3):241-247.

[27] GOPAL P K, PRASAD J, SMART J, et al. In vitro adherence properties ofLactobacillusrhamnosusDR20 andBifidobacteriumlactisDR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxigenicEscherichiacoli[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 67(3):207-216.

[28] SAMOT J, LEBRETON J, BADET C. Adherence capacities of oral lactobacilli for potential probiotic purposes[J]. Anaerobe, 2011, 17(2):69-72.

[29] 王坤, 閆穎娟, 姜梅,等. 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生物膜形成研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(19):184-187.

[30] LIN W H, WU C R, FANG T J, et al. Adherent properties and macrophage activation ability of 3 strains of lactic acid bacteria[J]. Journal of Food Science, 2011, 76(1):M1-M7.

[31] 趙煜. 具有拮抗空腸彎曲桿菌功效的乳酸菌的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2012.

[32] MORITA H, HE F, FUSE T, et al. Adhesion of lactic acid bacteria to CaCo-2 cells and their effect on cytokine secretion[J]. Microbiology & Immunology, 2002, 46(4):293-297.

AnalysisonbiologicalcharacteristicsoflacticacidbacteriaanditsantagonisticactivityagainstCampylobacterjejunicolonizationinmice

WANG Gang1*, HE Yu-feng1, CHEN Xiao-hua2,ZHAO Jian-xin1, ZHANG Hao1, CHEN Wei1

1(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(College of Life Science and Environment, Hengyang Normal University, Hengyang 421008, China)

In this study, 3-week-old C57BL / 6 mice were used to establish a infection model byCampylobacterjejuni. 8 strains of lactic acid bacteria capable of inhibiting the growth ofCampylobacterjejuniin vitro were engaged to estimate the antagonistic activity againstCampylobacterjejunicolonizationinvivo. Meanwhile, the biological characteristics such as the growth rate, acid production ability, biofilm formation ability and adhesion ability of the 8 strains were also measured. It was found that the differences of biological characteristics inter-species of 8 strains were greater than that of biological characteristics intra-species.Furthermore, the ability of lactic acid bacteria to antagonizeCampylobacterjejunicolonization in mice was positively correlated with the adhesion ability of bacteria.LactobacillusplantarumN8 and N9 with the highest adhesion index could effectively removeCampylobacterjejuniin the intestine of model mice. These two strains have the potential application value to prevent the human body fromCampylobacterjejuniinfection. This study also provides a theoretical basis for the screening of probiotics with antagonistic ability against pathogens.

lactic acid bacteria;Campylobacterjejuni; antagonistic activity; adhesion ability; mice infection model

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014093

博士，副教授(本文通訊作者，E-mail：wanggang@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31601444，31301407)

2017-02-20，改回日期：2017-03-09