嗜鹽四聯球菌及其在發酵食品中的應用

王博，周朝暉，李鐵橋，盧麗玲，陳堅,4，堵國成，方芳*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山，528415) 4(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

嗜鹽四聯球菌及其在發酵食品中的應用

王博1,2，周朝暉3，李鐵橋3，盧麗玲3，陳堅1,2,4，堵國成1,4，方芳1,2*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山，528415) 4(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

嗜鹽四聯球菌是一類存在于醬油、魚醬、豆制品等多種發酵食品及糖漿中的耐鹽或耐高滲的乳酸菌。它們在食品發酵過程中可提高食品中有機酸、醛類和酯類等風味物質含量，具有廣泛的應用價值。該文對嗜鹽四聯球菌的分類、生理生化特性、鑒定、脅迫環境下適應機制以及在發酵食品中的功能特性等幾個方面的研究進展進行了綜述。

發酵食品；嗜鹽四聯球菌；分類；鑒別

1 嗜鹽四聯球菌簡介

嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)是一類存在于發酵食品及糖漿中的嗜鹽或嗜高滲的乳酸菌[1]，早期被歸類為足球菌屬(Pediococcus)，稱為嗜鹽足球菌(Pediococcushalophilus)或醬油足球菌(Pediococcussoyae)[2]。Collins等在研究足球菌與氣球菌(Aerococcus)系統發育關系中時發現，有些菌株與所研究的足球菌序列同源性較低，將它們重新分類并命名為四聯球菌屬(Tetragenococcus)[3]。四聯球菌屬目前已經識別了5個種，包括嗜鹽四聯球菌(T．halophilus)、鹽水四聯球菌(T.muriaticus)、韓國四聯球菌(T.koreensis)、弧四聯球菌(T.solitarius)、嗜高滲四聯球菌(T.osmophilus)[4]。嗜鹽四聯球菌與足球菌等乳酸菌的系統發育關系見圖1，由16S rDNA系統發育樹可以看出，嗜鹽四聯球菌與腸球菌和氣球菌親緣關系較近。

嗜鹽四聯球菌是高滲發酵食品中常見的四聯球菌屬的菌種，不同來源的菌株在環境耐受性和生理生化特性上有一定的區別。JUSTé等通過遺傳分析方法，包括隨機擴增多態性DNA標記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、16S rDNA系統發育分析和重復序列PCR(repetitive sequence-PCR，rep-PCR)技術，將從不同來源篩選得到的耐鹽嗜鹽四聯球菌和耐高滲透壓嗜鹽四聯球菌歸類為2個種群[5]。根據抗高滲透壓耐脅迫等表現型并結合RAPD基因類型，也可將嗜鹽四聯球菌分為2個亞種，即分離自糖漿的Tetragenococcushalophilussubsp.flandriensis亞種，和分離自發酵魚類和發酵豆制品的Tetragenococcushalophilussubsp.halophilus亞種。其中T.halophilussubsp．flandriensis在糖漿濃度達到69 °Bx時仍可生長，而T．halophilussubsp.halophilus在濃度高于65 °Bx后便不能正常生長[4]。

圖1 基于16S rDNA測序構建嗜鹽四聯球菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of T．halophilus based on 16S rDNA sequencing

1.1嗜鹽四聯球菌的遺傳特性和生理生化特性

嗜鹽四聯球菌是革蘭氏陽性細菌，細胞不運動，非孢子形成球菌(直徑約0.6～1 mm)，顯微鏡下其細胞多呈四聯球型，周圍有胞外多糖，對提高菌株耐鹽性有一定作用。菌株表現為氧化酶陰性，過氧化氫酶通常情況下為陰性，但部分嗜鹽四聯球菌在高鐵血紅素存在時，過氧化氫酶為陽性[6-8]。該屬種的菌株為兼性厭氧，有氧條件不利于嗜鹽四聯球菌生長。嗜鹽四聯球菌菌落形態為白色，圓形，表面光滑，可在MRS液體培養基中緩慢生長(約3～5 d)，在固體培養基中生長周期一般為5～7 d。其可生長的鹽濃度范圍為0%～25%(w/v)，可生長溫度范圍為15～40 ℃，高于45 ℃不可生長，可在pH 5～9.6范圍內生長。嗜鹽四聯球菌葡萄糖代謝終產物為乳酸，其基因組G+C含量為34%～37%[3-4]。

注：+：陽性；-：陰性。

通常所有嗜鹽四聯球菌均可發酵葡萄糖、果糖、甘露糖等糖類產酸；不可發酵淀粉、木糖等糖類；是否利用阿拉伯糖、甘油、棉子糖、海藻糖等碳源在不同菌株間情況不同。例如：分離自糖漿的嗜鹽四聯球菌均可發酵阿拉伯糖和乳糖產酸，而分離自腌魚、醬油中的嗜鹽四聯球菌不能發酵這2種糖類，說明不同來源的嗜鹽四聯球菌對于糖類的發酵和利用有所區別[4]。此外，UDOMSIL等在泰國魚醬中篩選到的嗜鹽四聯球菌M11、MS33、MRC10-1-3等菌株對于甘油和蔗糖的發酵情況也不相同。這說明相同來源的嗜鹽四聯球菌，不同菌株之間對于糖類發酵也有所區別[9]。

1.2嗜鹽四聯球菌的鑒定

嗜鹽四聯球菌與鹽水四聯球菌均為細胞是四聯體形態的中度嗜鹽乳酸球菌，共同存在于多種腌制品與發酵食品中。四聯球菌屬的這2種菌具有相似的生理特征與遺傳學特征[10-12]。但是，嗜鹽四聯球菌一般在腌制品和發酵食品中起有益作用，鹽水四聯球菌則沒有相關的有益功能。因此鑒別和區分2種菌并監測食品發酵過程及發酵體系中嗜鹽四聯球菌的存在具有重要意義。由于2種菌相似度較高，常用的細菌種屬鑒定方法如16S rRNA基因序列比對分析較困難區分二者。KOBAYASHI等利用限制性內切酶片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)方法成功區分了這2種菌[13]，這種方法耗時較長且需使用特定儀器。KUDA等使用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)有效地區分了這2種相近的四聯球菌屬的菌株：同種菌的質譜峰相似度高于78%，嗜鹽四聯球菌與鹽水四聯球菌的質譜峰相似度則為36%。采用這種方法獲得的這2種四聯球菌與其他乳酸球菌包括弧四聯球菌的相似度均低于24%，可以高效且準確得將各菌種進行區分[14]。

2 嗜鹽四聯球菌與發酵食品

嗜鹽乳酸菌是生產發酵食品的發酵劑的重要微生物組成，它們具有提高發酵食品產品質量或者縮短發酵周期等作用。嗜鹽四聯球菌是腌制類發酵食品中微生物的最重要組成之一，廣泛存在于醬油、發酵豆制品、魚醬和咸魚等發酵食品中。將嗜鹽四聯球菌與堿性蛋白酶或風味蛋白酶結合加入發酵食品中，可以提高產品中揮發性物質和游離氨基酸的含量，起到提高產品風味的效果[15-16]。因此，了解嗜鹽四聯球菌對環境脅迫的適應機制，對于在發酵食品生產中應用嗜鹽四聯球菌，以及有針對性的改善食品風味和優化食品品質具有重要作用[17-20]。

2.1嗜鹽四聯球菌對環境脅迫的適應機制

發酵食品中，高的滲透壓、酸脅迫等多重環境因素影響著微生物的生存與生理代謝。高滲透壓環境使細胞內部水分流失，改變胞內物質濃度，影響細胞生理活動甚至造成細胞死亡。研究證明，嗜鹽細菌通常有2種機制以適應外部環境的高滲脅迫：一是調節胞內離子濃度，即在胞內Na+含量升高時積累K+；二是細胞通過合成或者吸收相容性溶質來平衡環境中較高的離子濃度，相容性溶質包括氨基酸、糖類及其衍生物[21-23]。

與其他嗜鹽菌相似，嗜鹽四聯球菌也是氯化物依賴性細菌。在高鹽脅迫下，嗜鹽四聯球菌通過轉運肉毒堿、甘氨酸甜菜堿或者將膽堿轉化為甘氨酸甜菜堿來積累調滲物質[24]。熱休克反應是存在于多種生物體內的應激反應，細胞在應激時合成的一組蛋白質為熱休克蛋白。關于熱休克蛋白編碼基因在高滲透壓條件下功能和表達的研究表明，GroESL，DnaK和ClpB充當功能性分子伴侶，提高了嗜鹽四聯球菌對高鹽度的適應性[25-26]。LIU等在轉錄組學基礎上對嗜鹽四聯球菌耐鹽性進行了研究，結果表明，嗜鹽四聯球菌在不同鹽濃度條件下，基因表達水平差異較大。在合適的鹽濃度下，轉錄、翻譯、膜系統、細胞分裂相關基因表達量明顯提高，有助于細菌生長；在偏高的鹽濃度下，表達量提高的主要為grpE,groES,clpE,hslV等編碼熱休克蛋白的基因和rpoD等編碼ABC轉運蛋白的基因。ABC轉運蛋白利用ATP在細胞膜內外轉運離子、糖類、氨基酸等多種親水物質，可以起到調節滲透壓的作用[23]。這些調節機制使嗜鹽四聯球菌具有適應外部高滲透壓的能力，使其在發酵食品中有重要的應用價值。

酸性環境會影響微生物細胞膜的通透性和相關酶活，進而影響細胞的生長與代謝。研究證明，調節細胞膜脂肪酸組成是微生物應對外界脅迫因素的方法之一，而嗜鹽四聯球菌可通過提高細胞膜中不飽和脂肪酸含量來抵御酸脅迫[27-28]。氨基酸可以穩定細胞膜與蛋白質結構，避免細胞受到脅迫因素的迫害，例如：谷氨酸脫羧酶將胞外谷氨酸轉化為γ-氨基丁酸，反應可消耗H+；精氨酸脫亞氨基(ADI)途徑中，精氨酸被微生物轉化為瓜氨酸和鳥氨酸，代謝產物包括NH3和ATP，都對細菌的耐酸性有一定貢獻[29]。HE等證明以上氨基酸轉化途徑對增強嗜鹽四聯球菌耐酸性同樣有作用，并通過研究證明，嗜鹽四聯球菌通過酸預適應處理后，耐酸性有顯著提高[30]。

2.2嗜鹽四聯球菌對發酵食品風味的影響

風味物質是表征發酵食品的重要特征之一，主要包括芳香類風味物質和味感風味物質，根據化合物結構又可分為醇類、醛類、酯類、酮類、萜類化合物與氨基酸等。發酵食品的風味物質主要通過化學反應和生物方法合成。生物合成風味物質主要有2種途徑，一是前體物質經過酶的催化作用轉化為風味物質；二是利用微生物代謝葡萄糖、蛋白質等營養物質，來生產某些風味物質，即微生物發酵法生產風味物質[31]。

UDOMSIL等研究發現，嗜鹽四聯球菌在高鹽環境中仍可水解蛋白質，并且具有胞內氨肽酶活性。在魚醬發酵過程中添加嗜鹽四聯球菌可以顯著提高魚醬中總氨基酸和游離氨基酸的含量，使鮮味氨基酸，如谷氨酸等的含量有所提高。添加嗜鹽四聯球菌的魚醬中，對風味有積極影響的揮發性物質如2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和苯甲醛等的含量也明顯增加[9,32]。WU從中國豆瓣醬中篩選到1株嗜鹽四聯球菌，并將其作為發酵劑接種至豆瓣醬發酵中用于強化豆瓣醬的風味。結果顯示，接種嗜鹽四聯球菌后，豆瓣醬中的氨態氮、酸類、醇類等揮發性成分均有所提高，而亞硝酸鹽含量減少了39.4%[7]。因此，通過添加嗜鹽四聯球菌，不僅可以提高發酵食品、調味品的風味，還能有效減少發酵食品中的有害物質。

很多發酵食品的生產過程都有酵母菌參與代謝。酵母菌以食品為原料的發酵代謝產物主要為醇類和醛類，嗜鹽四聯球菌的代謝產物則主要是乳酸等多種有機酸類，兩者結合，可顯著提高產品中酯類物質含量，起到改善產品風味的作用。例如在醬醪中強化酵母菌可以提高醬油中乙醇、2-苯乙醇、2-乙基丙酸酯、呋喃酮等物質含量，其中呋喃酮具有明顯增香效果；而向醬醪中接種嗜鹽四聯球菌后，醬油中乙酸、甲酸、2-羥基丙酸甲酯、香草醛、甲硫基丙醛、糠醛和糠醇等揮發性成分含量都有提高。糠醛和糠醇分別具有甜味和焦糖風味，醬醪體系中由于接種嗜鹽四聯球菌使得有機酸含量提高，加速了糠醛的生成[33-36]；CUI等通過先接種嗜鹽四聯球菌，后接種耐鹽酵母菌的方式，使醬醪中醇類、酮類、吡嗪類物質含量明顯提高，證實了嗜鹽四聯球菌對增加風味物質含量的貢獻程度要大于酵母菌，將它與酵母菌結合使用，風味物質含量增加比例最高[37]。同樣，將嗜鹽四聯球菌與酵母菌結合作為發酵劑發酵豆豉，除增加揮發性風味成分外，還可縮短發酵周期[38]。以上結果表明，嗜鹽四聯球菌在各類發酵食品中均有提高產品風味的作用，也可以與酵母菌等微生物組合使用，可以作為優良的發酵劑，具有廣闊的應用前景。

2.3嗜鹽四聯球菌對發酵食品安全的影響

水產品和肉制品在發酵過程中由于乳酸菌對含氮物質的不完全利用會產生氨基甲酸乙酯、生物胺等胺類物質。布氏乳桿菌、短乳桿菌、明串珠菌屬和足球菌都可產氨基脫羧酶導致發酵過程中產生組胺、色胺和酪胺等生物胺[39]，多種乳酸菌中存在的組氨酸脫羧酶可催化組氨酸脫羧生成組胺。酪胺可導致人體高血壓，組胺可引起一些過敏反應，國家標準規定組胺含量：鮐魚≤100 mg/100g、其他魚類≤30 mg/100 g；上海市地方標準暫定發酵肉制品中組胺限量為≤200 mg/kg[40]。氨基甲酸乙酯為2A類致癌物質(具有潛在致癌性)，前體物質為尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸等。而一些乳酸菌可以通過精氨酸脫亞氨基途徑(Arginine deiminase pathway,ADI)將精氨酸轉化為瓜氨酸，有潛在的危害性[8]。降低發酵食品中有害物質的含量有助于保障食品的安全性，所以應關注發酵食品中微生物的氨基酸代謝與有害物質形成之間的聯系。

已經報道的嗜鹽四聯球菌全基因組中有完整的ADI代謝途徑，廖淡宜在研究中發現篩選自醬醪的嗜鹽四聯球菌R23可以在高鹽的環境中將精氨酸和瓜氨酸轉化為鳥氨酸，對瓜氨酸的利用率為17.7%，瓜氨酸到鳥氨酸的轉化率為100%，既可以降低有害物質含量，也可以提高產品風味[8]。但是不同嗜鹽四聯球菌菌株之間ADI代謝途徑的基因型與表現型有一定區別，并且在實際應用期間受到低溫等環境因素影響，降低氨基甲酸乙酯及其前體物質瓜氨酸的能力有限，需要進一步研究選擇合適的菌株應用于生產[41]。

SATOMI等分析嗜鹽四聯球菌在含有1%L-組氨酸的組氨酸培養基中可產生3 mg/mL的組胺[42]。UDOMSIL等研究發現嗜鹽四聯球菌在含有5%～25%氯化鈉和0.25%組氨酸的改良GYP培養基中可合成0.06%～0.22 mg/mL的組胺，因此將該菌歸類為中等組胺產生菌[9]。JEONG等對嗜鹽四聯球菌進行了安全評估，結果表明嗜鹽四聯球菌不同菌株產酪胺水平差別較大[43]。在魚醬的發酵中添加嗜鹽四聯球菌，則可使樣品中組胺和酪胺含量均減少，減少魚醬中生物胺產生[32]。KUDA等從發酵水產品中篩選到兩株嗜鹽四聯球菌HmF-131和HmS-129，HmF-131可使沙丁魚在發酵過程中組胺含量升高，HmS-129則使組胺含量降低[44]。上述研究結果表明，合適的嗜鹽四聯球菌菌株不僅不會增加發酵食品中的生物胺，還能減少發酵食品中某些生物胺的生成。因此，發酵食品中組胺的產生可能與體系中其他微生物的氮源代謝相關。在實際生產中可選擇能降低生物胺含量的嗜鹽四聯球菌株作為發酵劑，提高發酵食品的安全性。

2.4嗜鹽四聯球菌的益生作用

乳酸菌廣泛存在于人體中，可以起到調節腸胃正常菌群、控制內毒素、抑制有害微生物及物質產生等多種益生作用，對人體的營養、生理功能和免疫反應等具有重要意義。近年來，一些報道指出嗜鹽四聯球菌可起到促進健康的益生菌作用。MASUDA等研究表明分離自醬油的嗜鹽四聯球菌Th221有助于調高Th1型免疫應答。通過體外和體內實驗發現，嗜鹽四聯球菌可以促進小鼠腹腔巨噬細胞產生抗腫瘤及抗感染的白細胞介素-12，并隨著介質中含鹽量增加(≥10%，w/v)，這一促進作用增強[45]。NISHIMURA等將嗜鹽四聯球菌Th221應用于治療常年性變應性鼻炎(TAR)時發現，口服高劑量(60 mg/d的Th221實驗組在實驗結束后患者鼻炎嚴重程度和鼻塞癥狀有明顯好轉，試驗期間患者的噴嚏流涕癥狀也有所改善，說明嗜鹽四聯球菌Th221可以改善TAR癥狀[46]，有應用于改善過敏癥狀的潛力。

3 結論

對來源于發酵食品的嗜鹽四聯球菌的遺傳特性和生理生化特性的深入研究，一方面可以豐富研究者關于耐鹽菌的知識，另一方面可以為探究嗜鹽四聯球菌在食品發酵過程中發揮的作用與利用價值提供理論支持。最近對嗜鹽四聯球菌的研究表明，嗜鹽四聯球菌在高鹽的發酵食品中可以提高揮發性成分含量，減少生物胺類有害物質的含量。但嗜鹽四聯球菌不同菌株間生理特性以及物質代謝情況有所差異，選擇合適的菌株可以強化食品風味，提高食品安全性，甚至賦予食品一定保健功能，所以需要對其進行進一步的系統研究，以更好的應用于發酵食品生產。

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Tetragenococcushalophilusanditsapplicationinfermentedfoods

WANG Bo1,2,ZHOU Zhao-hui3,LI Tie-qiao3,LU Li-ling3,CHEN Jian1,2,4,DU Guo-cheng1,4,FANG Fang1,2*

1(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry ofEducation,School of Biotechnology,Wuxi 214122,China) 3(Guangdong Pearl River Bridge Biological Limited Corporation,Zhongshan 528415,China) 4(Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Wuxi 214122,China)

Tetragenococcushalophilusis a kind of halophilic or osmophilic lactic acid bacteria,which widely presents in soy sauce,fish sauce,bean products,sugar thick juice and other fermented foods.Strains from this species are proved to play important roles in formation of flavor substances such as organic acids,aldehydes and esters during food fermentation process.In this review,classification and identification ofT.halophilus,the physiological and biochemical characteristics,stress response as well as the functional properties ofT.halophilusin fermented foods were discussed.

fermented foods;Tetragenococcushalophilus; taxonomy;characterization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014014

碩士研究生(方芳副教授為通訊作者,E-mail:ffang@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31371821)；廣東省科技計劃項目(2015B020205002)；江南大學自主科研計劃重點項目(JUSRP51734B)

2017-02-10，改回日期：2017-04-21