miR-218對新藤黃酸抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖作用的影響及機制研究

石玉榮，劉 健，陳素蓮，楊 瀅

(蚌埠醫學院1. 生物化學與分子生物學教研室、2. 檢驗診斷學實驗中心、3. 第一附屬醫院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233003)

miR-218對新藤黃酸抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖作用的影響及機制研究

石玉榮1，2，劉 健3，陳素蓮1，2，楊 瀅1

(蚌埠醫學院1. 生物化學與分子生物學教研室、2. 檢驗診斷學實驗中心、3. 第一附屬醫院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233003)

目的研究miR-218對新藤黃酸抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖作用的影響及其可能的分子機制。方法人宮頸癌HeLa細胞轉染過表達真核表達載體pmiR-218, real-time PCR檢測HeLa細胞miR-218的表達。將HeLa細胞分為空白對照組、新藤黃酸組、pmiR-218組、質粒對照組、新藤黃酸聯合pmiR-218組。MTT法檢測各組細胞增殖；流式細胞儀檢測各組細胞凋亡；Western blot檢測Bcl-2、Bax、E-cadherin表達；real-time PCR檢測Bcl-2、Bax和E-cadherin 的mRNA表達水平。結果miR-218真核表達載體pmiR-218轉染HeLa細胞后，細胞內miR-218表達水平明顯增加(P<0.05)。miR-218可提高 HeLa細胞對新藤黃酸的敏感性，高表達miR-218能促進新藤黃酸對HeLa細胞的增殖抑制作用，促進細胞凋亡，下調新藤黃酸對HeLa細胞Bcl-2/ Bax蛋白的表達水平。結論miR-218可提高HeLa細胞對新藤黃酸的敏感性，miR-218能增強新藤黃酸對HeLa細胞增殖抑制作用，并促進HeLa細胞凋亡，其作用機制可能與下調 Bcl-2/Bax的表達有關。

新藤黃酸；miR-218；HeLa細胞；細胞增殖；細胞凋亡；Bcl-2/Bax

新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)是中藥藤黃中的主要成分之一，基礎研究表明，GNA可抑制胃癌、肝癌、非小細胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌等多種癌細胞增殖[1-3]。微小RNA(microRNAs， miRNAs)是一類長約21～23個核苷酸序列的單鏈非蛋白編碼的RNA分子，在多種腫瘤中可有異常表達，對腫瘤的發生發展具有重要的調節作用。研究表明，miRNA-218(miR-218)在宮頸癌細胞中表達缺失或低表達，過表達 miR-218 可誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，具有抗宮頸癌的作用。本文以宮頸癌HeLa細胞為研究對象，轉染miR-218真核表達載體，并聯合使用GNA，探討miR-218對GNA抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖作用的影響及機制，為臨床聯合應用治療宮頸癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑人子宮頸腺癌HeLa細胞為本實驗室凍存。GNA購自中國上海士鋒生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養基，購自Gibco公司；脂質體LipofectamineTM2000、TRIzol，購自Invitrogen公司；miR-218 Real-time PCR試劑盒，購于上海吉瑪制藥技術有限公司；MTT試劑，購于Sigma公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，購于南京凱基生物科技發展有限公司；BCA蛋白濃度定量檢測試劑盒，購于碧云天生物技術研究所；ECL化學發光劑，購自Thermo公司；Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-E-cadherin抗體，購自Santa Cruz公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，購自Promega公司。

1.2Real-timePCR檢測轉染pmiR-218對HeLa細胞miR-218表達的影響實驗分組:空白對照組、pmiR-218組和空質粒對照組，每個組設3個復孔。pmiR-218和空質粒的 DNA轉染濃度為0.05 mg·L-1。將細胞以1.5 ×108·L-1接種于24孔板，按 LipofectamineTM2000說明書要求，轉染質粒。轉染48 h后，離心收集細胞，按TRIzol操作說明書提取各組細胞總RNA。按real-time PCR試劑盒操作說明書要求，檢測細胞內 miR-218的表達水平。用2-△△Ct方法進行相對定量分析。

1.3MTT法檢測pmiR-218對GNA抑制HeLa細胞增殖作用的影響將HeLa細胞按1×108·L-1接種于96孔板，設4個復孔，按LipofectamineTM2000操作說明書要求，轉染質粒。實驗分組：空白對照組、空質粒對照組、pmiR-218組。3組細胞分別加入不同濃度的GNA。GNA濃度為0、0.63、1.25、2.50 、5.0、10.0 mg·L-1。轉染48 h后，進行MTT檢測，全自動酶標儀檢測553 nm處各孔的光密度(OD)值。增殖抑制率/%=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100% 。藥物增敏倍數=單純用藥組的IC50/聯合用藥組的IC50。

1.4流式細胞術檢測GNA聯合pmiR-218對HeLa細胞凋亡的影響實驗分組：空白對照組、GNA組、pmiR-218組、空質粒對照組、 GNA+pmiR-218組。GNA濃度為2.0 mg·L-1。將HeLa細胞以1.5×108·L-1接種于24 孔板，轉染方法同前。48 h后，離心收集細胞，用PBS洗滌3次，按Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書加入試劑，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5Westernblot檢測GNA聯合pmiR-218對HeLa細胞內蛋白表達的影響實驗分組及轉染方法同前。轉染48 h后，裂解細胞提取蛋白，按蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量并校正。取等量蛋白樣品加入樣品裂解液，置沸水中煮5 min，SDS-PAGE電泳，轉膜。TBST洗膜后，5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜。TBST脫色，加入二抗，37℃孵育1 h。加入 ECL 顯影，曝光，以β-actin作為內參照，對條帶進行灰度分析。

1.6qRT-PCR檢測GNA聯合pmiR-218對HeLa細胞相關基因表達的影響實驗分組同前。取5組宮頸癌HeLa細胞培養72 h后，收集細胞。按TRIzol操作說明書，提取各組細胞總RNA。按Real-time PCR試劑盒操作說明書要求，檢測細胞內 Bcl-2、Bax、E-cadherin的mRNA表達水平。用β-actin基因作為內參，2-△△Ct方法進行相對定量分析。

2 結果

2.1HeLa細胞內miR-218的相對表達水平Fig 1的real-time PCR結果顯示，HeLa細胞轉染pmiR-218 后，細胞內 miR-218 的表達水平相對于對照組和空質粒組均明顯增加，轉染空質粒組和對照組相比無明顯變化。表明HeLa細胞轉染 pmiR-218 后，細胞內miR-218 的表達水平明顯增高。

2.2轉染pmiR-218，檢測GNA對HeLa細胞的增敏作用單獨使用GNA，IC50為5.68 mg·L-1，GNA和pmiR-218聯合應用IC50為1.94 mg·L-1(P<0.05) ，增敏倍數為2.93，兩者聯用為協同作用(Tab 1)。提示，高表達miR-218能夠提高HeLa細胞對GNA的藥物敏感性。進一步應用2.0 mg·L-1GNA和pmiR-218聯合，用MTT檢測對細胞生長的影響。由Tab 2結果可知，單獨使用GNA組和單獨轉染pmiR-218組，對HeLa細胞生長均有抑制作用，與空白對照組和空質粒組相比，差異有顯著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218聯合作用HeLa細胞，增殖抑制作用明顯增強，與GNA組和pmiR-218組相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。

Fig 1 The relative expression level of miR-218 in HeLa cells

*P<0.05vscontrol

Tab 1 Inhibitory effects of gambogenic acidcombined with pmiR-218 on proliferation of HeLa cells

*P<0.05vs0 mg·L-1GNA

Tab 2 Gambogenic acid combined withpmiR-218 on HeLa cell growth

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsgambogenic acid;△P<0.05vspmiR-218

2.4GNA聯合pmiR-218對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響5組HeLa細胞培養72 h后，收集各組細胞，流式細胞術檢測細胞凋亡。由Fig 2可見，GNA組和轉染pmiR-218組細胞凋亡率明顯高于對照組，GNA和pmiR-218聯合應用組，細胞凋亡率明顯高于GNA組和pmiR-218組。

2.5Westernblot檢測GNA和pmiR-218聯合應用對HeLa細胞蛋白表達的影響如Fig 3所示，單獨使用GNA和轉染pmiR-218后，宮頸癌HeLa細胞Bcl-2蛋白表達均較對照組降低，而Bax和E-cadherin蛋白表達增加，與對照組相比，差異均具有顯著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218聯合應用后，進一步降低HeLa細胞Bcl-2蛋白表達，上調Bax和E-cadherin蛋白表達，與單獨使用GNA和pmiR-218組相比，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.6qRT-PCR檢測GNA聯合pmiR-218對HeLa細胞Bcl-2、Bax和E-cadherin基因表達的影響如Fig 4所示，GNA組和轉染pmiR-218組宮頸癌HeLa細胞Bcl-2的mRNA水平明顯下降，與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)；GNA和pmiR-218聯合應用于宮頸癌HeLa細胞，Bcl-2的表達下降更加明顯，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，與GNA組和pmiR-218組相比，差異均有顯著性(P<0.05)；GNA組和轉染pmiR-218組Bax和E-cadherin的mRNA表達水平增加，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。GNA和pmiR-218聯合應用組，Bax和E-cadherin的mRNA表達增加與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)，與GNA和pmiR-218組相比，差異均具有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Effects of gambogenic acid combined with pmiR-218 on apoptosis of cervical cancer HeLa cells

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

Fig 3 Effects of gambogenic acid combined with pmiR-218on expression of Bcl-2, Bax and E-cadherin protein in HeLa cells

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

3 討論

藤黃酸是中藥藤黃的主要成分，在細胞增殖、侵襲、多藥耐藥方面發揮抗腫瘤作用，現作為I類新藥，進入臨床試驗階段。現代研究證實，GNA也為藤黃抗腫瘤作用的主要有效成分，在多種癌細胞系和肝癌小鼠模型中，具有抑制腫瘤生長的作用，且有效治療劑量及毒副作用明顯低于藤黃酸，有望開發成抗腫瘤新藥。但GNA作為化療藥物單獨使用，其作用有限，且存在一定的毒副作用，而聯合用藥可能會降低GNA的用量，并減少毒副作用，同時提高其抗腫瘤作用。

Fig 4 Effects of gambogenic acid combinedwith pmiR-218 on mRNA expression of Bcl-2,Bax and E-cadherin in cervical cancer cell line HeLa

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsGNA;△P<0.05vspmiR-218

近年大量的研究顯示，miRNAs在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用。miRNAs 是一種小分子、非編碼的RNA，通過與靶mRNA的3′UTR結合，阻礙mRNA翻譯或者誘導 mRNA 分解，從而實現對基因轉錄后的調控。miRNA 與腫瘤細胞形成、侵襲、轉移密切相關，miRNA通過與靶基因RNA堿基配對，引導沉默復合體降解RNA或阻礙其翻譯[4]。miRNA在多個組織中的差異表達，使表達圖譜分析成為研究的重點，miRNA在腫瘤耐藥和上皮間質轉化中發揮重要作用[5-6]。將 miRNA與化療藥物聯合應用，發現miRNA 可以通過調控抑癌基因、癌基因或凋亡相關基因的表達，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[7]。

近年來，關于miR-218在腫瘤中的異常表達的現象備受關注。研究發現，多種惡性腫瘤中存在著miR-218表達下調的現象，如頭頸鱗癌[8]、膀胱癌[9]、鼻咽癌[10]等。現研究證實，宮頸癌組織中microRNA表達譜發生明顯改變，且其與宮頸癌的發生進展密切相關。研究表明，miR-218表達下調與HPV感染相關，miR-218表達降低與宮頸癌發生發展密切相關[11]。我們的前期研究也證實了miR-218在宮頸癌組織中表達下調，上調miR-218表達，可抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用[12]。

本研究通過將 miR-218的真核表達載體(pmiR-218)轉染 HeLa細胞，上調宮頸癌細胞中miR-218的表達，與GNA聯用后，HeLa細胞對GNA的敏感性提高到單獨使用GNA的2.93倍，兩者表現為協同抗腫瘤作用。提示兩者聯合使用較單獨使用GNA具有更強的抗宮頸癌效果。

GNA和pmiRNA-218共同作用于宮頸癌細胞，探討二者聯合應用對宮頸癌的抗腫瘤作用。流式細胞儀檢測結果顯示，單獨使用GNA和轉染pmiR-218均能誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。兩者聯合應用后，細胞凋亡率較單獨用藥組明顯增加，提示GNA轉染pmiR-218的協同抗腫瘤作用可能與共同誘導HeLa細胞凋亡相關。

細胞凋亡與多種細胞因子表達異常相關。Bax基因是人體最主要的抗凋亡基因，屬于Bcl-2 基因家族，編碼的Bax 蛋白可與Bcl-2 形成異二聚體，對Bcl-2 產生阻抑作用。研究發現，Bax/Bcl-2 兩蛋白之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，因此認為，Bax是重要的促細胞凋亡基因之一[13-14]。本研究結果顯示，GNA和pmiR-218兩者聯合應用后，Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達明顯下調，較單獨用藥組相比，差異有顯著性。qRT-PCR結果亦顯示，兩者聯合應用能進一步上調Bax基因表達，下調Bcl-2蛋白表達。這些結果均提示，轉染pmiR-218聯合GNA的協同抗腫瘤作用，可能與共同誘導HeLa細胞凋亡相關。

發現新的抗腫瘤靶點、開發特異性的靶向抗腫瘤藥物，并與傳統藥物聯合應用，在當今腫瘤治療研究中顯示出良好的發展前景。本研究將GNA與靶向miRNA技術聯合使用，提高HeLa細胞對GNA的敏感性，為靶向基因治療與傳統化療聯合應用抗腫瘤提供了實驗依據，為宮頸癌的輔助治療提供新的思路。

(致謝：本實驗主要在蚌埠醫學院臨床檢驗診斷學中心實驗室完成，在此對實驗室的各位老師及同學的幫助致以衷心的感謝！)

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InhibitingeffectsofgambogenicacidincombinationwithmiR-218oncervivalcancerHeLacellsanditsmechanisms

SHI Yu-rong1,2, LIU Jian3, CHEN Su-lian1,2, YANG Ying1

(1.DeptofBiochemistryandMolecularBiology; 2.ResearchCenterofClinicalDiagnosticsLab;3.DeptofOncologicalSurgery;BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233003,China)

AimTo study the inhibitory effects of gambogenic acid in combination with miR-218 on cervical cancer HeLa cells and its mechanisms.MethodsEukaryotic expression vector of miR-218(pmi8-218) was transfected into HeLa cells. Transcript levels of miR-218 were quantified by real-time quantitative PCR. HeLa cells were incubated with different concentrations of gambogenic acid alone or in combination with pmiR-218. The cell growth inhibiting ratio of HeLa cells was assessed by MTT assay. Cell apoptosis was measured by fluorescence activated cell sorting. The expression levels of Bcl-2, Bax and E-cadherin were measured by Western blot and qRT-PCR.ResultsLevels of miR-218 transcript significantly increased in pmiR-218 transfected HeLa cells. Overexpression of miR-218 may enhance the sensitivity of HeLa cells to gambogenic acid. Over expression of miR-218 could enhance the effect of gambogenic acid on inhibition cell proliferation, promoting apoptosis of HeLa cells. pmiR-218 could enhance the regulation of Bax expression and decrease the expression of Bcl-2 in HeLa cells.ConclusionsOver expression of miR-218 may enhance the sensitivity of HeLa cells to gambogenic acid; miR-218 can enhance the effect of gambogenic acid on inhibition cell proliferation and promote the apoptosis of HeLa cells, and the mechanism may be related to down-regulation of Bcl-2/Bax expression.

gambogenic acid; miR-218; HeLa cells; proliferation; apoptosis; Bcl-2/ Bax

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.015

A

：1001-1978(2017)10-1405-05

R284.1；R329.24；R329.25；R394.2；R737.330.22

時間：2017-9-5 9:26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.030.html

2017-05-16,

2017-06-28

安徽省教育廳自然科學基金資助項目(No KJ2014A162)

石玉榮(1974-)，女，碩士，副教授，研究方向：腫瘤分子生物學，通訊作者，E-mail: shiyr@126.com