eNOS參與鐵過載誘導的血管內皮細胞線粒體損傷

何 歡，張澤宇，劉 丹，廖章萍，尹 東，何 明

(南昌大學 1. 藥學院江西省基礎藥理學重點實驗室、2. 第二附屬醫院江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌 330006)

eNOS參與鐵過載誘導的血管內皮細胞線粒體損傷

何 歡1，張澤宇1，劉 丹1，廖章萍1，尹 東2，何 明1

(南昌大學 1. 藥學院江西省基礎藥理學重點實驗室、2. 第二附屬醫院江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌 330006)

目的探討eNOS及ADMA/DDAHⅡ介導的鐵過載對HUVECs細胞線粒體的損傷作用。方法常規培養HUVECs細胞，隨機分為正常對照(Ctrl)組、右旋糖酐鐵(Iron) 組、L-精氨酸(L-Arg)組。48 h后，MTT法檢測細胞存活率；HPLC法檢測ADMA含量及DDAHⅡ活性；Western blot法檢測eNOS表達；比色法檢測培養液LDH活性、NO含量、細胞MDA含量以及mPTP開放；流式細胞儀檢測心肌細胞ROS含量、線粒體膜電位及細胞凋亡。結果Iron處理48 h后，HUVECs細胞存活率明顯降低，培養液ADMA及LDH活性升高，NO含量減少；細胞eNOS表達下調、DDAHⅡ活性降低；MDA含量與ROS生成明顯增加，線粒體膜電位減小，mPTP大量開放，細胞凋亡增加；ADMA生理性對抗劑L-Arg則可明顯減弱Iron的上述損傷作用。結論eNOS參與鐵過載誘導的HUVECs細胞線粒體損傷，ADMA/DDAHⅡ機制也可能發揮了作用。

鐵過載；線粒體；ADMA；eNOS；DDAHⅡ；細胞凋亡

近年來，鐵過載誘發細胞、組織損傷逐步引起人們的注意。研究發現，鐵在體內具有很強的氧化活性，機體鐵過載時可導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生[1-2]。血管內皮細胞對ROS極為敏感，是鐵過載損傷的主要靶細胞之一[3]。血管內皮細胞產生非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)與細胞內ROS生成互為因果，調控內皮細胞功能，與多種血管內皮功能失調性疾病高度相關，是一種心血管疾病危險因子[4]。ADMA在鐵過載引起的血管內皮細胞損傷中的作用及其機制尚未見報道。本文選用人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，以梯度右旋糖酐鐵(iron dextran)確認造成鐵過載損傷，分別檢測HUVECs細胞內ADMA含量、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 表達、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶Ⅱ(dimethylarginine dimethylaminohydrolaseⅡ, DDAHⅡ)活性等及其相應的細胞線粒體功能；加用ADMA生理性對抗劑L-精氨酸(L-Arg)[5]，探討鐵過載對HUVECs細胞線粒體的損傷作用及其機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑右旋糖酐鐵(Iron)、右旋糖酐(Dex)、L-Arg：Sigma公司；eNOS、β-actin 抗體及相應二抗：Santa Cruz公司；蛋白提取試劑盒：北京普利來公司；胎牛血清、MEM培養基：Gibco BRL公司；ROS檢測試劑盒、線粒體分離試劑盒：Sigma-Aldrich公司；線粒體膜電位檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒：BD公司產品；增強化學發光印跡試劑、硝酸纖維素膜：Amersham, UK；MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、EDTA和DTT：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2細胞系及培養HUVECs購自中國科學院細胞庫。HUVECs細胞培養于含10% FBS的DMEM培養基中，置于37℃ CO2培養箱培養。細胞生長接近融合狀態(70%～80%)時，備用。

1.3實驗分組①正常對照(Ctrl)組：取正常培養HUVECs細胞，常規培養24 h；②Iron組：取正常培養HUVECs細胞，加入終濃度分別為30、15、7.5、3.75、1.875 μmol·L-1右旋糖酐鐵，孵育24 h；③Dex組：取正常培養HUVECs細胞，加入終濃度分別為30、15、7.5、3.75、1.875 μmol·L-1右旋糖酐，孵育24 h；④L-Arg組：取正常培養HUVECs細胞，加入終濃度為7.5 μmol ·L-1右旋糖酐鐵，以及終濃度為1 mmol ·L-1L-Arg孵育24 h。

1.4MTT比色法檢測細胞存活率胰酶消化收集細胞，以每孔104個細胞接種96孔培養板。細胞融合達70%～80%后，棄培養基；加入MTT溶液(5 g·L-1溶于PBS)每孔20 μL，37℃孵育4 h；棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min。酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其OD值。細胞存活率/% = (實驗組光吸收值/對照組光吸收值) ×100%。1.5HPLC法檢測細胞培養液ADMA含量[6]實驗結束后，取細胞培養液0.5 mL，加5-磺基水楊酸沉淀蛋白，離心10 min后，取上清液上樣，激發波長338 nm，發射波長425 nm檢測ADMA含量。

1.6細胞DDAHⅡ活性測定[6]采用間接法檢測。冰浴下將細胞裂解液分為2份，分別加入終濃度為500 μmol·L-1ADMA；一份立即加入30% 5-磺基水楊酸滅活DDAHⅡ；另一份37℃孵育2 h后，再加入30% 5-磺基水楊酸滅活DDAHⅡ。用HPLC法測定2份的ADMA水平，其ADMA差值反映DDAHⅡ活性。

1.7Westernblot法檢測細胞eNOS表達實驗結束后，按試劑盒方法提取細胞總蛋白；BCA 法蛋白定量后行SDS-PAGE電泳(12%分離膠)；濕轉PVDF膜、封閉；eNOS抗體( 1 ∶500) 或β-actin 抗體( 1 ∶500) 孵育，4℃過夜。洗膜后以1 ∶2 000二抗孵育1 h 后，ECL化學發光法檢測。X線片掃描后，用Quantity One 圖形分析軟件分析，以β-actin 相應條帶的密度標化相應組的eNOS條帶密度。

1.8生化檢測實驗結束后，各組分別取培養液200 μL，Beckman生化自動分析儀測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性；消化收集且反復凍融破碎細胞，離心后取上清液，按試劑盒說明書測定細胞內一氧化氮(nitric oxide, NO)及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。

1.9流式細胞術測定細胞內ROS含量[7]實驗結束后，4℃預冷PBS洗滌2～3次細胞；加入含0.02%乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，用10 μmol·L-1DCFH-DA溶液500 μL重懸細胞，37℃孵育30 min；800×g、5 min離心，棄上清，預冷PBS洗滌2～3次細胞，制成108·L-1的懸液，立即以488 nm為激發波長，以530 nm為發射波長行流式細胞儀檢測，以不加DCFH-DA的1管為陰性對照。1.10流式細胞術測定細胞線粒體膜電位[7]實驗結束后，4℃預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)洗滌2～3次細胞；加入含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，用10 μmol·L-1JC-1溶液200 μL重懸細胞，37℃孵育20 min；800×g、5 min離心，棄上清，預冷PBS洗滌2～3次細胞，制成109·L-1的懸液，立即行流式細胞儀檢測，分別以488 nm 為激發光波長，527 nm 和590 nm 為發射光波長測綠色和紅色熒光強度，以各組紅/綠熒光強度的比值反映線粒體膜電位水平。

1.11線粒體通透性轉運孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mPTP)開放測定以線粒體腫脹實驗揭示mPTP開放情況[8]。實驗結束后，4℃預冷PBS洗滌2～3次細胞；按試劑盒說明書分離、純化線粒體；線粒體蛋白終濃度為0.5 g·L-1，25℃、pH 7.4；1 min后加入150 μmol·L-1CaCl2，分光光度儀檢測線粒體在520 nm處的吸光度(OD520) 在l min內的變化，持續檢測20 min。

1.12細胞凋亡檢測[8]采用AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀檢測。實驗結束后，4℃預冷PBS洗滌2～3次細胞；用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集細胞；用預冷PBS洗2次后，用1×Binding buffer重懸細胞，細胞密度約為5×109·L-1；分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI；重懸后，室溫避光孵育15 min，加入500 μL Binding buffer，立即以激發光488 nm、發射光578 nm行流式細胞儀檢測，各組陽性細胞百分率用于表示細胞凋亡狀況。

2 結果

2.1右旋糖酐鐵對HUVECs細胞存活率以及培養液LDH活性的影響MTT結果顯示(Fig 1)，經不同濃度右旋糖酐鐵處理48 h后，細胞存活率降低、培養液LDH活性增加 (P<0.01)，3.75～30 μmol·L-1區間呈明顯的劑量依賴性；而同步進行的、對應濃度的右旋糖酐處理的HUVECs細胞存活率和培養液LDH活性均無改變(P>0.05)，表明相應劑量的右旋糖酐鐵造成的HUVECs細胞損傷，源于Fe2+毒性，與滲透壓改變等因素無關。鑒于7.5 μmol·L-1位于右旋糖酐鐵處理劑量區間中段，本文后續實驗中凡涉及右旋糖酐鐵處理的終濃度均為7.5 μmol·L-1。

2.2右旋糖酐鐵損傷的HUVECs中eNOS蛋白表達改變Western blot 結果顯示(Fig 2)，與對照組相比，Iron組細胞eNOS蛋白表達明顯下調(P<0.01)；而1 mmol·L-1L-Arg可明顯減弱右旋糖酐鐵下調細胞eNOS表達的作用。

2.3右旋糖酐鐵損傷的HUVECs中DDAHⅡ活性、MDA、ADMA、NO含量的改變如Tab 1所示，Iron組細胞DDAHⅡ活性明顯降低，MDA 含量升高(P<0.01)，培養液中ADMA含量明顯增加(P<0.01)，NO含量減少(P<0.01) ；而1 mmol ·L-1L-Arg可明顯逆轉右旋糖酐鐵的相關作用。

**P<0.01vsprior dosage

Fig 2 Iron overload down-regulated eNOSexpression in HUVECs(±s, n=8)

**P<0.01vsControl;##P<0.01vsIron

2.4右旋糖酐鐵損傷的HUVECs中ROS的變化如Fig 3所示，HUVECs經右旋糖酐鐵處理后，ROS生成明顯增加(P<0.01)；而1 mmol ·L-1L-Arg處理后，細胞ROS生成明顯降低(P<0.01)，提示L-Arg可減輕鐵過載引起的ROS爆發。

Fig 3 Iron overload induced ROSgeneration in HUVECs(±s, n=8)

**P<0.01vsControl;##P<0.01vsIron

2.5右旋糖酐鐵損傷的HUVECs細胞線粒體膜電位的變化如Fig 4所示，HUVECs經右旋糖酐鐵處理后，線體粒膜電位明顯減小(P<0.01)；而1 mmol·L-1L-Arg處理后，線粒體膜電位明顯恢復(P<0.01)，表明L-Arg可穩定線體粒膜電位。

Fig 4 Iron overload loss of mitochondriamembrane potential in HUVECs(±s, n=8)

**P<0.01vsControl;##P<0.01vsIron

2.6右旋糖酐鐵對HUVECs細胞mPTP開放的影響如Fig 5所示，HUVECs經右旋糖酐鐵處理后，其線體粒受到CaCl2刺激后極易腫脹(P<0.01)，即線體粒的mPTP易于開放；而1 mmol·L-1L-Arg處理后，線粒體對CaCl2刺激明顯耐受(P<0.01)，表明L-Arg可使mPTP關閉。

2.7右旋糖酐鐵對HUVECs細胞凋亡的影響如Fig 6所示，HUVECs經右旋糖酐鐵處理后，其陽性細胞百分率明顯高于對照組(P<0.01)；與之相比，1 mmol·L-1L-Arg處理后，細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。

Fig 5 Iron overload opened mitochondrialpermeability transition pores in HUVECs (±s, n=8)

**P<0.01vsControl;##P<0.01vsIron

Fig 6 Iron overload induced apoptosis in HUVECs(±s, n=8)

**P<0.01vsControl;##P<0.01vsIron

3 討論

研究表明[4-6, 11]，L-Arg與ADMA可競爭性抑制eNOS，影響NO生成，調控血管內皮細胞功能以及血管張力。ADMA由內皮細胞產生，被DDAHⅡ降解、失活。DDAHⅡ對細胞內ROS增加極為敏感而使活性降低，使得ADMA堆積。ADMA不僅與L-Arg競爭eNOS，使NO生成減少，影響內皮細胞功能以及血管張力，且可通過“NOS脫偶聯”機制，即eNOS不能催化L-Arg的雙電子氧化生成NO，反而產生超氧離子(更多ROS生成)，而對DDAHⅡ產生更為強大的抑制，形成惡性循環，最終導致血管內皮細胞功能衰竭。本實驗首次發現，7.5 μmol·L-1右旋糖酐鐵處理24 h可使HUVECs細胞eNOS表達下調、DDAHⅡ活性降低、MDA含量增加，而培養液中ADMA含量明顯增加、NO含量明顯減少(由于未能檢測p-eNOS變化，難以確認NO含量改變與eNOS表達下調間的因果關系)；而用1 mmol·L-1L-Arg同步處理后，鐵離子的上述作用明顯減弱，表明鐵過載造成的HUVECs細胞損傷與eNOS有關，也很可能有ADMA/DDAHⅡ的參與。

近年來發現，線粒體不僅控制細胞的能量代謝，而且在維持細胞鈣穩態、調節細胞凋亡或壞死等過程中起著決定性作用[12]。某些觸發因素使得部分線粒體產生、釋放ROS，通過“活性氧引起的活性氧釋放”(ROS-induced ROS-release, RIRR)機制，正反饋性誘發周邊正常線粒體產生、釋放大量的ROS，即導致ROS爆發；引起線粒體膜電位振蕩，mPTP的開放，導致外膜破裂及線粒體不可逆損傷；隨之基質腫脹，外膜破裂，細胞色素C等凋亡信號分子釋放，導致細胞凋亡或死亡[3, 13]。本實驗首次發現，7.5 μmol·L-1右旋糖酐鐵處理48 h可使HUVECs細胞ROS生成明顯增加，線粒體膜電位減小，mPTP的開放，細胞凋亡明顯增加；而用1 mmol·L-1L-Arg同步處理后，鐵離子的上述作用明顯減弱，表明鐵過載成的HUVECs細胞損傷與其線粒體功能衰竭有關。

Tab 1 Effects of iron dextran on intracellular MDA content, DDAHⅡ activity, and ADMA, NO content in cultured medium (±s, n=8)

**P<0.01vsControl;##P<0.01vsIron.

綜上所述，鐵過載可引起HUVECs細胞ROS形成，可能在eNOS以及ADMA/NO/ DDAHⅡ參與下，使得ROS惡性生成，進而激活RIRR機制，誘發mPTP過度開放，最終導致內皮細胞功能衰竭。

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MitochondrialdamageinducedbyironoverloadviaeNOSinvascularendothelialcells

HE Huan1, ZHANG Ze-yu1, LIU Dan1, LIAO Zhang-ping1, YIN Dong2, HE Ming1

(1.JiangxiProvincialKeyLabofBasicPharmacology,SchoolofPharmaceuticalScience,NanchangUniversity,Nanchang330006,China; 2.JiangxiProvincialKeyLabofMolecularMedicine,theSecondAffiliatedHospitaltoNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

AimTo investigate the damage of mitochondria in HUVECs cells by iron overload and the role of ADMA/eNOS/DDAHⅡ in it.MethodsHUVECs cells were cultured and randomly divided into normal control (Ctrl) group, dextran iron (Iron) group and L-arginine (L-Arg) group. After 48 h, the survival rate of cells was detected by MTT assay; ADMA content and DDAHⅡactivity were measured by HPLC method; the expression of eNOS was determined by Western blot; LDH activity, MDA and NO content, and mitochondrial permeability transition pores(mPTP) openness were determined by colorimetric assay; ROS generation, mitochondrial membrane potential and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsAfter 48 h treatment with iron, the survival rate of HUVECs significantly decreased, while the activity of LDH in culture medium increased. The results showed that ADMA and MDA content significantly increased, NO content, DDAHⅡactivity, and the expression of eNOS markedly decreased, the generation of ROS was evidently elevated, mitochondrial membrane potential was lost apparently, mPTP openness was obvious, and the apoptosis of the HUVECs were worsened. However, as ADMA physiological antagonist, L-Arg significantly attenuated the above effects of iron.ConclusionIron overload could damage mitochondrial function by eNOS and induce the apoptosis of HUVECs, in which ADMA/DDAHⅡ mechanism may also be engaged.

iron overload; mitochondria; ADMA; eNOS; DDAH II; cell apoptosis

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.025

A

：1001-1978(2017)10-1457-05

R329.24；R329.25；R543；R589.9；R591.1

時間：2017-9-5 9:26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.050.html

2017-06-06，

2017-08-10

國家自然科學基金資助項目(No 21467017)

何 歡(1988-)，女，博士，講師，研究方向：心血管損傷與保護，E-mail：hannahhe1988@hotmail.com； 尹 東(1956- )，女，碩士，教授，研究方向：細胞內信號通路傳遞，通訊作者，E-mail：dongyin24@126.com； 何 明(1956- )，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管損傷與保護，通訊作者，E-mail：jxhm56@163.com