Nrf2-ARE信號通路在左乙拉西坦抗癲癇中的作用

吳 可，趙文麗，李月影，邱長雨，施海靜，張詠梅

(徐州醫科大學麻醉學院，江蘇 徐州 221004)

Nrf2-ARE信號通路在左乙拉西坦抗癲癇中的作用

吳 可，趙文麗，李月影，邱長雨，施海靜，張詠梅

(徐州醫科大學麻醉學院，江蘇 徐州 221004)

目的探討Nrf2-ARE信號通路在左乙拉西坦抗癲癇中的作用，以及應用左乙拉西坦對認知功能的影響。方法成年♂ SD大鼠36只，250～300 g，隨機分為生理鹽水對照(control)組、戊四唑(1,5-pentamethylene-1H-tetrazole，PTZ)癲癇模型組、左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)對照組以及左乙拉西坦治療組，每組9只。以Morris水迷宮測試大鼠的空間學習記憶能力；用免疫印跡法測定海馬組織中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達量。結果與癲癇模型組相比，給予左乙拉西坦治療的癲癇大鼠在Morris水迷宮測試中潛伏期明顯縮短(P<0.05)，海馬Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達均明顯增高(P<0.01)。結論左乙拉西坦能夠改善癲癇大鼠的認知功能，其機制可能通過Nrf2-ARE通路，使HO-1、NQO1蛋白表達增多，起到抗癲癇的作用。

癲癇；Nrf2；ARE；信號通路；左乙拉西坦；認知功能

癲癇是由腦組織局部病灶的神經元異常高頻放電，并向周圍擴散，導致大腦功能短暫失調綜合征。癲癇主要臨床表現為突然發作，出現短暫運動、感覺、意識和精神異常，并反復發作，發作時常伴有異常腦電圖。反復癲癇發作的患者常伴有認知功能障礙。癲癇的發病機制非常復雜，迄今尚未完全闡明。氧化應激損傷、谷氨酸興奮性毒性、鈣超載、神經膠質細胞增生等多種因素都能誘導神經元異常放電，觸發癲癇。其中，氧化應激在癲癇發病中起著重要的作用，可影響腦組織神經元的功能，誘導海馬神經元的凋亡[1]，且癲癇的持續時間與氧化損傷呈正相關。有研究表明，部分抗癲癇藥物可以通過調節氧化應激系統改善癲癇患者的癥狀。

Nrf2/ARE通路是機體抵抗內、外界氧化和化學等刺激的防御性轉導通路[2]，其核心分子包括核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)和胞質蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白 1(Kelch ECH associating protein 1,Keap1)。核轉錄因子Nrf2屬于CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族(cap-‘n’-collar subfamily of basic leucine-zipper, CNC-Bzip)，Nrf2活化還能抑制炎癥介質的生成[3]。Keap是與Nrf2的直接結合蛋白[4]。Keap1含有5個主要結構域，分別是氨基末端NTR、BTB、富半胱氨酸插入域IVR、雙甘氨酸重復域DGR以及羧基端CTR。其中，IVR和BTB容易進行氧化還原反應，是調控Nrf2所必需的結構。DGR的6個Kelch功能域形成β折疊結構，與Nrf2的Neh2端序列結合[5]。Keap1在體內抑制Nrf2的活性，允許Nrf2從細胞質轉位到細胞核并增強ARE的反應。ARE是一個特異的DNA 啟動子結合序列，能被多種氧化性和親電性化合物激活，從而啟動Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達。

左乙拉西坦(levetiracetam, LEV)作為新型廣譜的抗癲癇藥已廣泛應用。有研究表明，突觸囊泡蛋白SV2A是抗癲癇藥左乙拉西坦的結合位點[6]，其作用機制為阻斷突觸前神經遞質的有效釋放[7]，但其確切機制并未完全明確。左乙拉西坦可以扭轉鋅等負變構調節劑對γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和甘氨酸門控電流的抑制作用，可以抑制三磷酸肌醇受體 (inositol triphosphate receptor,IP3R)和蘭尼堿受體(ryanodine receptor, RyR)介導的鈣離子釋放[8]，還可以減少鉀電流，這些都與其抗癲癇作用相關。左乙拉西坦在癲癇等疾病中還有神經保護作用，且能改善顱腦損傷后的認知[9]。

本實驗旨在探討左乙拉西坦抗癲癇的可能機制，明確Nrf2-ARE信號通路在左乙拉西坦抗癲癇中的作用。有研究表明，抗癲癇藥苯巴比妥鈉對大鼠學習記憶功能有損害[10]，本實驗通過水迷宮模型探討左乙拉西坦對認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物成年SD大鼠36只，♂，體質量250～300 g，由山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK(魯)20140007。大鼠置于晝夜(12 h/12 h)節律光照條件下，室溫(23±1)℃，自由飲水和攝食，所有大鼠實驗前靜養1周。

1.2實驗分組隨機將大鼠分為4組，每組9只。生理鹽水對照(Control)組：0.9% 生理鹽水(normalsaline, NS)+0.9% NS；戊四唑(pentylenetetrazole, PTZ)癲癇模型組：0.9% NS+戊四唑；左乙拉西坦(LEV)對照組：LEV(20 g·L-1)+0.9% NS；左乙拉西坦(LEV)治療組：LEV(20 g·L-1)+戊四唑。大鼠首先用8號灌胃針進行灌胃，灌胃物質為分組中的前一試劑，劑量均為10 mL·kg-1。灌胃30 min后，以分組中的后一試劑進行腹腔注射，大約于每天上午8 ∶00～10 ∶00進行，劑量均為2 mL·kg-1。以上各組動物平均體質量差異無統計學意義。1.3儀器與試劑Morris水迷宮購自上海軟隆科技發展有限公司產品。左乙拉西坦片購自優時比制藥有限公司；戊四唑購自Aladdin公司；抗Nrf2 (Lot:GR249953-6)、抗HO-1 (Lot:GR96795-23)、抗NQO1抗體 (Lot:GR195043-8)，均購自Abcam艾美捷科技有限公司。

1.4大鼠癲癇模型制備大鼠于每天上午8 ∶00～10 ∶00腹腔注射濃度為15 g·L-1的戊四唑溶液，連續28 d。模型成功與否以其發作時的行為變化為主要依據，按Racine分級，0級：無任何反應；1級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等；2級：1級加節律性點頭；3級：2級加前肢陣攣；4級：3級加后肢站立；5級：4級加摔倒。達到4～5級的大鼠選用，未達到4級的淘汰[11]。

1.5Morris水迷宮實驗Morris水迷宮為直徑125 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫保持(26.0±1.0)℃。池壁上有象征4個象限的不同標志，在一個象限的正中離池壁33 cm處放一個直徑9 cm、高28 cm的黑色平臺，平臺頂低于水面15 cm。訓練期間迷宮外參照物保持不變。Morris水迷宮測試大鼠對水迷宮的學習和記憶能力。定位航行實驗：將水池等分為4個象限，目標象限的中央放置一隱匿平臺，定位航行實驗共歷經5 d。實驗開始前l d，讓大鼠放入水池(不含平臺)自由游泳2 min，d 2開始每天分上、下午兩個時間段，每個時間段訓練4次。每個時間段分別從池壁2個起點將大鼠面向池壁放入水池，記錄每次找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)和游泳路徑。如大鼠在60 s內找不到平臺，由實驗者將其引上平臺，潛伏期記為 60 s，每次間隔 4 min 讓大鼠休息，再行下次實驗[12]。

1.6Western blot 行為學測試結束后，10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射對大鼠進行麻醉，后斷頭，取雙側海馬。將取出的海馬放入預冷的裂解液中，在冰上使用電動勻漿機進行勻漿，每個樣本勻漿4次，每次10 s，間隔10 s冷卻，充分裂解后離心。BCA法對裂解后的蛋白濃度進行定量，隨后加入5×上樣緩沖液(總體積1/4)，放入沸水中煮沸15 min促進蛋白變性。配制10%或者12%的膠進行恒壓電泳，電壓設置為：濃縮膠70 V， 35 min；分離膠110 V， 90～120 min。電泳結束后，采用PVDF膜冰上進行恒壓轉膜，100 V， 75 min。轉膜后，3% BSA封閉2 h，加入抗Nrf2、HO-1、NQO1 (1 ∶250)、GAPDH(1 ∶2 000)一抗孵育，4℃過夜。Washing buffer，搖床5 min×3次，加入堿性磷酸酶羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000，Abcam公司，英國)，室溫孵育2 h。二抗孵育后，Washing buffer，搖床5min×3次，顯色，采用Image J軟件進行灰度值分析。

2.1左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能的影響在Morris水迷宮測試中，各組大鼠給藥后d 1的逃避潛伏期無明顯差別，d 2、3、4、5的潛伏期均開始縮短(Fig 1A)。PTZ模型組總潛伏期相對于正常對照組明顯提高(P<0.01，Fig 1B)，表明大鼠癲癇模型制備成功；而LEV治療組可以明顯逆轉此改變，降低大鼠逃避潛伏期(P<0.05，Fig 1B)，表明應用左乙拉西坦可以改善癲癇大鼠的認知功能。

2.2Nrf2在左乙拉西坦抗癲癇中的表達變化Fig 2結果顯示，與control相比，PTZ致癲癇模型組海馬的Nrf2蛋白表達明顯降低(P<0.01)，說明在此模型中Nrf2介導的防御性轉導通路減弱；而給予左乙拉西坦治療后，與control組、PTZ模型組相比，海馬Nrf2蛋白表達明顯增加(P<0.01)，表明左乙拉西坦可能通過加強Nrf2通路的表達起到抗癲癇的作用。2.3HO-1在左乙拉西坦抗癲癇中的作用Fig 3結果顯示，與control組相比，PTZ致癲癇模型組海馬的HO-1蛋白表達明顯升高(P<0.01)；給予左乙拉西坦治療后，與control組、PTZ模型組相比，海馬HO-1蛋白表達水平進一步明顯增高(P<0.01)，表明左乙拉西坦治療后進一步升高的HO-1可能參與了抗癲癇作用。

Fig 1 The escape latency of S-D rats in training test

A: The change tendency of escape latency in rats during 5 days; B: Changes of total escape latency of rats in 5 days.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsPTZ group

Fig 2 Expressions of hippocampus Nrf2 in rats

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPTZ group

Fig 3 Expressions of hippocampus HO-1 in rats

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPTZ group

2.4NQO1在左乙拉西坦抗癲癇中的作用Fig 4結果顯示，與control組相比，PTZ致癲癇模型組海馬水平的NQO1蛋白表達明顯升高(P<0.01)；給予左乙拉西坦治療后，與control組、PTZ模型組相比，海馬NQO1蛋白表達水平進一步明顯增高(P<0.01)，表明左乙拉西坦治療后進一步升高的 NQO1可能參與了抗癲癇作用。

Fig 4 Expressions of hippocampus NQO1 in rats

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPTZ group

3 討論

作為神經科僅次于頭疼的第二大常見病，癲癇的預防和治療已成為醫學界的焦點問題，癲癇對大鼠的學習記憶損害機制并未明了。既往的研究發現，反復癲癇發作可以導致海馬結構發生病理變化，包括海馬神經元的變性壞死、突觸間隙異常增寬及突觸后膜的密度改變、海馬異常苔蘚樣發芽以及由此導致的突觸聯系異常，與學習記憶聯系緊密的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受體表達分布異常、信號轉導通路異常等。

Nrf2/ARE通路是機體抵抗內外界氧化和化學等刺激的防御性轉導通路，生理狀態下，Nrf2與Keap1相偶聯，且Keap1與胞質肌動蛋白結合而被錨定在胞質。Keap1還會促進Nrf2被泛素蛋白酶迅速降解保持低活性。而當Keap1構象變化，通過直接磷酸化或減少降解，競爭性抑制等方式均可激動Nrf2。Nrf2與Keap1解離，半衰期延長，以穩定狀態轉位進入細胞核。與小Maf蛋白結合形成異二聚體，然后識別ARE上DNA序列(GCTGAGTCA)，并與之結合形成復合物，誘導抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表達。包括血紅素氧化酶(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶[quinone oxidoreductase，NAD(P)H]以及其它參與氧化應激反應的基因[13]。HO-1和NADH是該通路編碼的重要的抗氧化酶。HO-1、 NADH含量升高，提高了細胞的氧化應激及修復功能。由此可見，真正發揮作用的Nrf2是在入核以后，但胞核的Nrf2表達過少，而以往有文獻指出，總Nrf2也可以間接反映各組間Nrf2表達變化的差別[14]。所以，我們在本實驗中以總Nrf2作為各組間比較的對象，間接反映各組間Nrf2表達的不同。

在癲癇發作時，可以誘導海馬組織中Nrf和其編碼的基因產物HO-1和NQO1在蛋白和基因水平表達明顯增強。LEV作為新型廣譜的抗癲癇藥已廣泛應用，但其抗癲癇機制并未完全明確。有研究表明，LEV對癲癇患者氧化應激系統有作用，但未探明到底通過何種途徑影響。上述已知機體可通過上調Nrf2，提高抗氧化水平和降低氧化產物水平，同時，Nrf2-ARE通路對認知功能的影響，提示LEV是否可以通過此通路起到抗癲癇作用，從而對癲癇患者認知障礙有改善作用。

本實驗結果表明，與模型組相比，給予LEV的癲癇大鼠潛伏期明顯縮短，海馬Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達明顯增高，提示LEV可能通過上調Nrf2，提高抗氧化水平和降低氧化產物水平。針對在Western blot結果中，在模型組中，Nrf2的表達是減少的，而其下游蛋白HO-1和NQO-1的表達是增多的結果，有研究表明HO-1基因的表達受多條通路的調控，其調控位點包括ABi序列、HSE區域、USF位點、NF-κB位點、E-box部位、STAP3/AP識別位點、Nrf2結構、UTR結構等多個方面[15]，調控HO-1基因表達的上游通路較多，所以我們暫且保留本實驗條件下的結果，在后續的實驗中將繼續探討。

針對癲癇患者常伴有認知功能障礙，實驗中應用的Morris 水迷宮是神經生物學研究動物空間學習、記憶功能常用的行為學檢測方法，能夠較準確地反映實驗動物以視覺為基礎的空間學習、記憶、定向及定位能力的變化。與對照組相比，模型組潛伏期明顯延長，與模型組相比，治療組潛伏期明顯縮短，表明LEV對癲癇大鼠的認知功能也有一定的改善作用。且本實驗采用的PTZ點燃癲癇模型，有組織學分析揭示該模型引起的海馬CA1 區神經元丟失和齒狀回苔蘚纖維發芽與人類癲癇極其相似。同時，也有研究表明該模型大鼠海馬p38蛋白表達減少，而p38作為突觸前終末特異性標記物, 用來檢測突觸的密度和分布, 是神經元功能狀態的標示物之一，這說明PTZ 點燃癲癇可能引起海馬突觸前膜突觸囊泡數量減少及功能受損、突觸活動減弱、神經遞質合成與釋放減少等一系列變化,從而導致了認知功能障礙[16]。這為癲癇后認知功能障礙機制的探討提供了有力證據。但癲癇后認知功能障礙機制復雜,還需要進一步的探索和研究。

綜上所述，左乙拉西坦能改善癲癇大鼠的認知功能，左乙拉西坦可能通過Nrf2-ARE通路使HO-1、NQO1蛋白含量表達增多，起到抗癲癇的作用。

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EffectsofNrf2-AREsignalpathonlevrtiracetamanti-epilepticandlevrtiracetamonlearningandmemorizingability

WU Ke, ZHAO Wen-li, LI Yue-ying, QIU Chang-yu, SHI Hai-jing, ZHANG Yong-mei

(SchoolofAnesthesiology,XuzhouMedicalUniverity,XuzhouJiangsu221004,China)

AimTo explore the effects of Nrf2-ARE signal path on levrtiracetam anti-epileptic and levrtiracetam on learning and memorizing ability.MethodsThirty-six SD rats were divided into normal saline group, levrtiracetam group, model group and treatment group. Each group recruited nine rats. Tests of Morries water maze were given to the rats to evaluate their learning and memorizing ability. The protein expression of nuclear factor (erythroid-derived2)-like2 (Nrf2), heme oxygenase 1(HO-1) and NAD(P)H quinone oxidoreductase(NQO1) were examined by Western blot.ResultsCompared with model group, levrtiracetam could shorten the plateau period in epileptic rats (P<0.05), and increase the expression of Nrf2 protein, HO-1 protein and NQO1 protein in hippocampus(P<0.05).ConclusionsLevrtiracetam could improve the learning and memorizing ability in epileptic rats. Levrtiracetam may increase the expression of HO-1 protein and NQO1 protein through the Nrf2-ARE pathway and play a part in antiepileptic effects.

epilepsia; Nrf2; ARE; signal path; levrtiracetam; learning and memorizing ability

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.026

A

：1001-1978(2017)10-1462-05

R-332；R322.81；R338.64；R742.1；R971.6

時間：2017-9-5 9:26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.052.html

2017-04-20,

2017-07-24

國家自然科學基金資助項目(No 81171041)；江蘇省高校自然科學基金重點項目(No 13KJA320001)；江蘇省自然科學基金資助項目(No BK20161171)；江蘇省大學生創新創業訓練計劃(No 201610313039Y)；江蘇高校品牌專業建設工程資助項目(No PPZY2015A066)

吳 可(1995-)，男，研究方向：疼痛信號轉導及其調控，E-mail:742296844@qq.com； 張詠梅(1970-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：疼痛信號轉導及其調控，通訊作者，E-mail: zhangym700@xzhmu.com.cn