ALK在肺腺癌中表達情況的分析及靶向治療

劉麗波，苗 帥，韓志峰，薛錦儒，辛 華，楊 斌*

(1.吉林大學第四醫院 腫瘤內科，吉林 長春130011；2.吉林大學中日聯誼醫院 a.老年病科；b.胸外科)

ALK在肺腺癌中表達情況的分析及靶向治療

劉麗波1，苗 帥2a，韓志峰2b，薛錦儒2b，辛 華2b，楊 斌2b*

(1.吉林大學第四醫院 腫瘤內科，吉林 長春130011；2.吉林大學中日聯誼醫院 a.老年病科；b.胸外科)

表皮生長因子受體(EGFR)突變檢測及其EGFR-TKI的使用是非小細胞肺癌(NSCLC)治療史上里程碑式的進展[1]。繼EGFR之后，間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排也己成為NSCLC尤其是肺腺癌中一個非常重要的分子亞型[2]。2007年Soda 等[3]首次在1 例肺腺癌組織標本中擴增出一種致瘤的變異融合基因—棘皮動物微管相關類蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)。隨后國內外多項研究發現該融合基因是除EGFR 突變及K-Ras 突變外的另一個重要的酪氨酸激酶抑制劑的作用靶點[4，5]。但鑒于ALK重排發生的陽性率較低，采用FISH方法作為篩選手段價格昂貴。本研究采用特定的檢測流程，從特定的腺癌人群中篩選出EML4-ALK融合基因陽性的患者，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取吉林大學中日聯誼醫院及吉林大學第四醫院2013-2015年手術切除和經皮肺穿刺活檢病理確診的不吸煙或輕度吸煙96例肺腺癌患者石蠟包埋組織。年齡32-77歲，平均年齡59歲；男性23例(24.0%)，女性73例(76.0%)。所有病例術前均未行化療、放療或靶向治療。一生中吸煙< 100支定義為不吸煙。按2009 國際肺癌研究學會( IASLC) 公布的第7 版肺癌TNM 分期標準:Ⅰ期6例，Ⅱ期12 例，Ⅲ期65 例，Ⅳ期13例。

采用實體瘤療效評價標準評價療效(RECIST，1.0 版)，療效判定包括完全緩解(CR)，部分緩解(PR)，疾病穩定(SD)及疾病進展(PD)。總緩解率(ORR)包括 CR 和PR。疾病控制率(DCR)包括 CR、PR和SD。本研究經吉林大學中日聯誼醫院倫理委員會及吉林大學第四醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及定量 石蠟包埋組織切片經二甲苯脫蠟及無水乙醇脫水后，采用FFPE gDNA Miniprep Kit(BIOMIGA公司) 提取基因組DNA，所有步驟按照說明書進行操作。DNA 提取后，用Nano-Drop fluorospectrometer(ND-1000，Thermal Fisher 公司) 檢測濃度，并且評估DNA質量。選取260/280比值在1.8-2.0之間的DNA樣品進行實驗。

1.2.2 用PCR-熒光探針法(ARMS)檢測肺癌組織中EGFR、KRAS基因突變，按試劑盒說明進行。

1.2.3 熒光原位雜交技術(FISH)檢測EML4-ALK融合基因 (1) FISH 檢測：采用直接法，Vysis LSI ALK 雙色分離重排探針試劑購自美國雅培公司。切片行常規二甲苯脫蠟，100%、85%和70%乙醇依次梯度水化，蛋白酶K(80 mg/ml，pH 2.0) 消化處理;4%中性甲醛固定后，再行70%、85%和100%乙醇梯度脫水，加入5 μl探針于組織切片上;置于原位雜交儀( DAKO公司)中，75℃變性10 min，37℃雜交16 h;然后將切片置洗滌液Ⅰ(0.4×SSC，0.3%NP-40)1min，洗滌液Ⅱ(2×SSC，0.1% NP-40)1 min去除多余探針，室溫暗處干燥加DAPI染色，封固，暗處放置20 min后在熒光顯微鏡(Olympus公司)100倍油鏡下觀察，分別在DAPI、FITC、RHOD 通道下觀察細胞內熒光信號并拍照記錄。

(2)結果判定方法:至少觀察50個腫瘤細胞，如果50個腫瘤細胞中至少有25個存在分離信號(>50%)則直接判斷為ALK FISH陽性;如果這50個細胞中分離信號細胞為5-25個(10%-50%)，則再重復計數50個細胞，若這100個腫瘤細胞中，超過15個腫瘤細胞存在分離信號(15%)，則判定為ALK FISH陽性。

1.2.4 統計學方法 應用SPSS 19．0 軟件進行統計學分析，EML4-ALK 各組間表達水平與各臨床病理參數之間的比較采用χ2檢驗、連續校正χ2檢驗或Fisher 精確概率。P<0.05為差異有統計學意義。

1.2.5 克里唑替尼靶向治療 (1)靶向治療對象：選取熒光原位雜交(FISH)檢測ALK融合基因陽性患者行克里唑替尼靶向治療。(2)藥物及劑量：克里唑替尼由美國輝瑞公司提供，250毫克，每日兩次口服。(3)靶向治療療效分析：①.選取靶向治療開始后8周考察患者對克里唑替尼靶向治療的反應率。②.選取8周、6個月及1年為時間點考察客觀緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)，其中療效判定按標準的實體瘤反應評價標準分類(RECIST)。

2 結果

2.1 對96例不吸煙或輕度吸煙肺腺癌患者進行了EML4-ALK、EGFR、KRAS的檢測，發現在中國肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR(39/96,43.3%)、KRAS (20/96,20.8%)、EML4-ALK (8/96,8.3%)。

2.2 37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽性(21.6%，8/37)。統計分析顯示，ALK陽性患者與ALK陰性患者年齡無差異(52.5歲vs.58歲，P=0.083)。男性和女性患者中ALK陽性率無差異(2/10,20.0%;6/27,22.2%,P=1.000 )。不同分期患者ALK陽性率也未見差異(P=1.000)。8例ALK陽性腫瘤中，6例(75.0%)為紅綠分離信號，2例(25.0%)為單紅信號。見表1。

表1 EML4-ALK融合基因陽性患者的臨床特征與陽性率的關系

2.3 靶向治療結果，因病例數較少無法進行克里唑替尼的客觀緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)的統計學分析，單純進行臨床療效觀察，每6-8周隨訪一次，截止隨訪時間1年，其中CR 1例，PR 3例，SD 2例，PD 2例。客觀緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)分別為50%和75%?；颊吣褪苄粤己茫尜|量明顯提高。

3 討論

間變性淋巴瘤激酶是目前非小細胞肺癌中研究較多的驅動基因[6]。ALK基因位于人類2號染色體短臂2p23區，它可與5號染色體上的啟動子序列NPM(nucleophosmin)轉位進行融合，導致ALK激酶的組成性激活。目前，ALK基因的異常激活驅動著多種腫瘤的形成，其活化形式包括基因重排，突變和基因擴增等。依賴ALK基因異常來驅動其生長被稱為“ALKOMA”，這一類腫瘤擁有共同的驅動靶點，并能從ALK靶向治療中獲益。EML4基因斷裂后與ALK基因的24號外顯子融合，形成EML4-ALK融合基因;EML4斷裂位點不同可以與ALK形成不同的EML4-ALK融合基因變體。

ALK融合基因檢測目前有FISH、RT-PCR和IHC等三種主要檢測手段，各種方法各有其優缺點。本研究采用原位免疫熒光法進行檢測以期達到最準確的結果。

既往研究顯示，EML4-ALK 融合基因在東亞地區肺癌患者中的發生率約為3%-7%，且更易表達于肺腺癌這一組織學亞型中[7]。林小梅等[8]報道在102 例國人NSCLC 患者中發現EML4-ALK融合基因的陽性表達率為7.8% (8/102)，且EML4-ALK 陽性患者中腺癌占62.5%。Shaw等[9]通過大樣本臨床研究發現歐美人群EML4-ALK 的陽性表達率為13.5%(19/141)，EML4-ALK 融合基因型者多為年輕男性、不吸煙或輕度吸煙的腺癌患者。而在本研究中EML4-ALK融合基因陽性表達率為8.3%，由于本研究中EML4-ALK 融合基因陽性患者樣本量較小，表現出其在年輕女性患者中多見，與既往研究結果不相符[10]，因此仍需大樣本資料作進一步研究。許多臨床前研究都證實ALK抑制劑能顯著抑制具有EML4-ALK融合基因的腫瘤生長[11]。多個臨床試驗也已證實克里唑替尼可以給具有ALK重排的患者帶來非常明顯的獲益[12，13]，然而并不是所有的ALK重排患者都能從克里唑替尼治療中獲益。

本研究中96例肺腺癌不吸煙或輕度吸煙患者進行了EML4-ALK、EGFR、KRAS的檢測，發現在中國北方肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR (39/96,43.3%)、KRAS (20/96,20.8%)、EML4-ALK(8/96,8.3%)。37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽性(21.6%，8/37)。ALK陽性患者與ALK陰性患者年齡無差異，與文獻報道不一致[14]，可能與病例數較少有關。男性和女性患者中ALK陽性率無差異，但從數量上看女性患者多于男性患者。不同分期患者ALK陽性率未見差異，但從表中所見ALK陽性患者多分期較晚。

因本組病例數較少，無法進行克里唑替尼的總緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)的統計學分析，單純進行臨床療效觀察，每6-8周隨訪一次，截止隨訪時間1年，其中CR1例，PR3例，SD2例，PD2例?？陀^緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)分別為50%和75%。尤其其中一例完全緩解的患者，為一中年女性，右下肺腺癌，雙側胸膜轉移伴大量胸腔積液，給予克里唑替尼治療8周后，胸腔積液完全消失，6個月后右肺腫物減小50%以上，且伴有中心壞死，表現出非常好的治療效果。

包括激酶抑制劑在內的抗腫瘤藥物的一個主要問題是毒性作用，最常見的不良反應為惡心、嘔吐、乏力、腹瀉。本組患者未見嚴重毒性反應，總體耐受性良好。

通過本研究我們獲得了在我國北方特定的人群中(肺腺癌不吸煙或輕度吸煙，EGFR、KRAS雙野生型)EML4-ALK的表達情況，同時通過對ALK陽性患者的靶向治療，觀察了克里唑替尼靶向治療的療效和毒性反應，為我國北方ALK陽性患者的靶向治療積累了一定的經驗，未來的研究需要提高樣本量或開展多中心合作，并需要大量的隨訪研究，為EML4-ALK融合基因的研究提供更充分的依據。隨著EML4-ALK 抑制劑克里唑替尼靶向治療的逐漸開展，將給這類亞型的肺癌患者帶來新的個體化靶向治療機會[15，16]。

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吉林省衛生計生委(2014ZC045)；吉林省科技廳國際合作處(3D513N203430)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1343-03

2016-04-11)