P-15肽促進間充質干細胞向軟骨細胞分化的分子機制及體內成骨作用研究

張 郡，楊利麗，劉欽毅，孟憲榮，劉 睿，王瑞強，田海清，萬 騰

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

P-15肽促進間充質干細胞向軟骨細胞分化的分子機制及體內成骨作用研究

張 郡，楊利麗，劉欽毅，孟憲榮*，劉 睿，王瑞強，田海清，萬 騰

(吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

目的通過細胞實驗研究發現P-15肽能有效激活、促進間充質干細胞增殖和向軟骨細胞分化，但是否在體內仍有類似作用尚不明確。因此，本研究旨在探討P-15肽可能如何激活、促進干細胞向軟骨細胞增殖分化，同時在體內功能狀態。方法培養鼠間充質干細胞在含有和不含有P-15肽的培養基中，培養6小時后，兩組細胞均用α5整合素抗體和pFAK抗體染色，進行免疫熒光染色，同時進行蛋白免疫印跡分析；在維斯塔小白鼠腹部皮下注射250 μl含有P-15+rhBMP-2或單純rhBMP-2的基質膠建立小鼠皮下異位骨化模型，術后12天處死小鼠，分離取下腹部基質膠行Micro CT及組織學檢查。結果①與對照組相比，P-15肽培養組pFAK和α5整聯蛋白的表達較對照組均有顯著性增高(P<0.05)；②Micro CT掃描、組織切片染色及免疫組織化學均提示P-15肽組基質膠周邊軟骨沉積，發現肥大軟骨細胞沉積在外圍區域。結論①P-15肽可能通過激活pFAK通路并上調α5整聯蛋白的表達促進MSCs向軟骨細胞分化；②P-15肽能促進局部組織軟骨沉積，進而出現組織骨化。

P-15肽；軟骨細胞；軟骨內骨化；分化；α5整合蛋白/pFAK信號通路

(ChinJLabDiagn,2017,21:1429)

脊柱融合手術是當前治療胸腰椎骨折最廣泛接受的手術方式[1]。在骨折愈合過程中，骨細胞形成是骨折愈合的關鍵因素，促進骨細胞形成能提高骨折愈合率、縮短愈合進程[2-4]。在骨細胞形成過程中，細胞外基質有重要作用，因此影響成骨率的一個關鍵因素是相互作用間質細胞的表面細胞外基質[5,6]。研究顯示P-15肽能促進纖維母細胞和骨母細胞增殖、粘附以及細胞外基質的分泌[7,8]，也能促進骨組織的形成[8,9]。體外實驗證實了P-15肽能有效激活、促進間充質干細胞增殖和向軟骨細胞分化。本研究旨在研究P-15肽促進間充質干細胞向軟骨細胞分化的分子機制及體內成骨作用。

1 材料和方法

1.1 細胞培養及免疫熒光染色

實驗選用鼠間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在DMEM培養基(Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium)中，37℃，5%CO2的孵箱內培養。將第6代細胞分為兩組：P-15肽組和空白對照組分別接種于均勻鋪有P-15肽的培養皿和空白培養皿中。培養6小時后，兩組細胞均用α5整合素抗體和pFAK抗體進行免疫熒光染色。

1.2 大鼠皮下異位骨化模型建立

所有關于大鼠手術操作過程均提交托馬斯杰弗森大學倫理委員會審議并通過。實驗動物為8-12周雄性維斯塔小白鼠，由查爾斯實驗室提供。小鼠在飼養室預適應2天后被分為兩組：P-15肽組和rhBMP-2組，P-15肽組注射含有P-15+ rhBMP-2的BD基質膠；rhBMP-2組注射含有rhBMP-2的BD基質膠。

將小鼠用異氟醚麻醉后，腹部區域備皮，術區消毒，將250 μl混合后基質注射進小鼠腹部形成皮丘，左側為P-15肽組，右側為rhBMP-2組。術后觀察小鼠生活狀態，有無并發癥。于術后12天用CO2處死小鼠，將腹部皮丘組織分離取下，進行下一步分析研究。

1.3 Micro CT分析

組織標本使用4%多聚甲醛固定，按照既往文獻說明方法放入Micro CT中掃描[10]。根據圖像數據進行具體骨量分析。

1.4 組織學分析

動物組織標本切片，進行蘇木精-伊紅染色。使用鼠抗人基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)，血管內皮生長因子(VEGF)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)單抗來進行免疫組織化學染色。染色切片進行定量數字拍攝。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 P-15肽可以激活p FAK，促進α5表達

與對照組相對比：培養基含有P-15肽的MSCs綠色熒光的為α5，紅色熒光的為pFAK，二者共同表達的區域為黃色熒光(如圖1所示)，表明P-15肽與α5整合蛋白表達存在相關性，α5與pFAK的表達也有明顯相關性，同時隨著細胞數的增加而熒光強度增加。

圖1 細胞免疫熒光

2.2 Micro CT檢查

組織固定后行掃描骨定量分析，P-15肽組骨化和軟骨沉積更明顯。

2.3 組織切片染色

組織切片行蘇木精-伊紅染色，如圖2所示P-15肽組整個基質膠周圍細胞染色較明顯，皮丘周圍軟骨組織沉積已經完成，肥大軟骨細胞沉積于皮丘周圍邊緣。

圖2 蘇木精-伊紅染色

2.4免疫組織化學染色

免疫組化熒光反應如圖3所示：P-15肽復合物周邊抗酒石酸酸性磷酸酶染色更明顯，發現更多肥大軟骨細胞。同時P-15肽組與對照組相比在MMP-13和VEGF水平上也有顯著性增加。

3 討論

脊柱骨折后的骨形成過程是一個骨細胞和細胞外基質形成的三維組合的復雜過程，包括以下兩種機制：膜內成骨和軟骨內成骨。軟骨內成骨由骨折端周圍的間充質形成與成骨類似的軟骨雛形，繼而出現原發性骨化位點，由此向兩端延伸進而出現骨髓腔。軟骨內成骨過程中細胞外基質的早期沉積對組織修復非常關鍵，有大量細胞因子參與，需要通過上調特定基因編碼的蛋白質表達進行基質重構。軟骨細胞分化成為肥大型軟骨細胞可以促進這樣的過程，而軟骨細胞的分化受到細胞外基質信號的調控。

圖3 免疫組織化學染色

既往實驗證明P-15肽通過α2β1整合素對骨分化和骨形成發揮作用，通過激活細胞基質中的整合素，誘導骨細胞和成骨細胞發生粘附，遷移，增殖和分化[8,11]。然而研究發現，在軟骨細胞形成和分化過程中，P-15肽并不直接與α2β1整合素蛋白結合，但卻可以通過上調該信號通路達到促進軟骨內骨形成[12]。

有研究證實α5β1整聯蛋白介導的細胞外細胞基質信號參與軟骨骨化[13,14]。本研究提示α5整聯蛋白可能在P-15肽作用于MSC細胞軟骨化進程中有舉足輕重的作用。蛋白免疫印跡實驗結果也提示P-15肽的作用下α5整聯蛋白的表達水平升高。FAK在細胞外基質整合素信號轉導中起重要作用，并調節Ⅱ型膠原表達和細胞增殖。Park等認為FAK可以調節軟骨細胞中的軟骨糖胺多糖分泌[15]。本研究中pFAK蛋白的表達水平也有明顯升高，與α5整聯蛋白呈明顯相關性。因此，P-15可能通過上調α5整聯蛋白的表達并激活pFAK通路促進MSC細胞向軟骨細胞分化。

體內實驗中實驗組皮丘周邊MSCs大量聚集，出現組織軟骨化和骨沉積。軟骨內成骨的特點為軟骨細胞肥大，軟骨基質鈣化，骨原細胞和血管長入肥大性軟骨細胞陷窩，骨組織在鈣化軟骨組織中心形成[16]。與對照組相比較，實驗組周邊肥大軟骨細胞聚集，從組織學角度證明了整個過程受軟骨內成骨機制的調控。

[1]RA Deyo,DT Gray,W Kreuter,et al.United States trends in lumbar fusion surgery for degenerative conditions[J].Spine,2005,30(12):1441.

[2]RK Siu,SS Lu,W Li,et al.Nell-1 protein promotes bone formation in a sheep spinal fusion model[J].Tissue Eng,Part A,2011,17 (7-8):1123.

[3]Reid JJ,Johnson JS,Wang JC.Challenges to bone formation in spinal fusion[J].J Biomech,2011,44(2):213.

[4]J Nerubay,B Marganit,JJ Bubis,et al.Stimulation of bone formation by electrical current on spinal fusion[J].Spine,1986,11(2):167.

[5]Ching-Fang Chang,Ming-Wei Lee,PY Kuo,et al.Three-dimensional collagen fiber remodeling by mesenchymal stem cells requires the integrin-matrix interaction[J].J Biomed Mater ResA,2007,80(2):466.

[6]RT Franceschi,C Ge,G Xiao,etal.Transcriptional regulation of osteoblasts[J].Cells Tissues Organs,2009,189(1-4):144.

[7]JY Lee,YS Choi,SJ Lee,et al.Bioactive peptide-modified biomaterials for bone regeneration[J].Curr Pharm Des,2011,17(25):2663.

[8]Qinyi Liu,Worawat Limthongkul,G Sidhu,et al.Covalent attachment of P15 peptide to titanium surfaces enhances cell attachment,spreading,and osteogenic gene expression [J].J Orthop Res,2012,30(10):1623.

[9]M Thorwarth,S Schultzemosgau,F Wehrhan,et al.Bioactivation of an anorganic bone matrix by P-15 peptide for the promotion of early bone formation[J].Biomaterials,2005,26(28):5648.

[10]Eaton GJ,Zhang QS,Diallo C,et al.Freeman TA Inhibition of apoptosis signal-regulatingkinase 1 enhances endochondral bone formation by increasingchondrocyte survival[J].Cell Death Dis,2014,5:e1522.

[11]Bhatnagar RS,Qian JJ,Gough CA.The role in cell binding of a beta-bendwithin the triple helical region in collagen alpha 1 (I) chain:structural and biological evidence for conformational tautomeric on fiber surface[J].J Biomol Struct Dyn,1997,(14):547.

[12]Zhang J,Eisenhauer P,Kaya O,et al.P15 peptide stimulates chondrogenic commitment and endochondral ossification[J].Int Orthop,2017,10.1007.

[13]Inoue T,Hashimoto R,Matsumoto A,et al.In vivo analysis of Arg-Gly-Asp sequence/integrin α5β1-mediated signal involvement in embryonic enchondral ossification by exo utero development system[J].J Bone Miner Res,2014,29(7):1554.

[14]Loeser R F.Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage[J].Matrix Biol,2014,39:11.

[15]Park MS,Kim YH,Lee JW.FAK mediates signal crosstalk between type II collagen and TGF-beta 1 cascades in chondrocytic cells[J].Matrix Biol,2010,29(2):135.

[16]M Okumura,A Ishikawa,T Aoyama,et al.Cartilage formation in the pelvic skeleton during the embryonic and early-fetal period[J].PLoS One,2017,12(4):e0173852.

MolecularmechanismofP-15peptidepromotingthedifferentiationofmesenchymalstemcellsintochondrocytesanditsfunctionofosteogenesisinvivo

ZHANGJun,YANGLi-li,LIUQin-yi,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveP15 peptide enhances chondrocyte differentiation and formation in vitro.However,the mechanism is unclear,and whether this is effective in vivo is not clear.In this study,we assessed the mechanism of chondrogenic differentiation in vitro.Further investigationto determine whether P15 could independently direct chondrogenesis or mineralization in vivo.MethodsTo determine if P15 enhances chondrogenic differentiation through integrin α5/pFAK signaling,we stained MSCs that had been maintained on either uncoated or P15-coated dishes using antibodies specific for α5 integrin or pFAK.Six hours after plating,the expression of integrin was determined by Western blot and fluorescent immunohistochemistry.Male Wistar mices

two injections ofMatrigel with bone morphogenetic protein2(BMP2) in the right abdominal region and two injections of Matrigel with P15 in the left abdominal region,respectively.12 days after injections,thetransplanted masses were excised and analyzed by micro CT and histology.ResultsCompare to the control group,cells grown in vitroon surfaces coated with the P15 peptide have increased α5integrin expression and show activation of FAK(P<0.05).When P15 was combined with BMP2,it was observed that an increased number of MSCs transformed into chondrocytes at D12.ConclusionP15 may interact indirectly with integrin α5/pFAK signaling to enhance chondrocyte differentiation.P15 has the ability to increase bone formation through endochondral formation.

P-15peptide;chondrocyte;Cartilage ossification;differentiation;integrin α5/pFAK signaling

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1429-03

Q813

：A

2016-11-16)