多重耐藥性銅綠假單胞菌的分離鑒定及小鼠燒傷感染模型的建立

郝羽翀，劉洋洋，王亞利，史紅艷

(吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021)

多重耐藥性銅綠假單胞菌的分離鑒定及小鼠燒傷感染模型的建立

郝羽翀，劉洋洋，王亞利，史紅艷*

(吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021)

目的分離鑒定多重耐藥性銅綠假單胞菌，制備銅綠假單胞菌感染的小鼠燙傷模型。方法常規方法分離純化銅綠假單胞菌，并經16sRNA序列分析鑒定銅綠假單胞菌；平板稀釋法測定分離菌株對18種抗菌藥物的耐藥性；應用燙傷儀確定小鼠對100℃下不同燙傷面積和燙傷時間的耐受情況，確定最佳燙傷時間和面積建立小鼠燙傷模型；對小鼠燙傷模型皮下感染不同濃度的銅綠假單胞菌，確定72 h內全部小鼠死亡的細菌最小致死量，最小致死量感染組小鼠死亡后立即應用平板稀釋法檢測肝和脾內細菌荷載量。結果分離鑒定得到5株多重耐藥性銅綠假單胞菌，其中耐藥種類最多的為PA53，該菌對檢測的18種抗菌藥物中的14種耐藥；燙傷溫度100℃，面積 2.5 cm2,燙傷時間10 s可獲得穩定的小鼠燙傷模型；PA53對小鼠燙傷模型感染的最小致死量為1.8×1011CFU/ml,250 μl；死亡小鼠肝和脾內的細菌荷載量分別為108PFU/g和1010PFU/g數量級。結論獲得多重耐藥性銅綠假單胞菌PA53；成功構建小鼠燙傷模型，并測定了PA53對燙傷模型小鼠的最小致死量及死亡小鼠部分臟器的細菌荷載量。

多重耐藥性;銅綠假單胞菌；燒傷模型；最小致死量

(ChinJLabDiagn,2017,21:1432)

銅綠假單胞菌是醫院感染最主要的條件致病菌之一。患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術后或某些治療后的患者易感染本菌。它是重癥監護室感染的第二位最常見的病原菌，燒傷時，焦痂下區域可成為大量細菌侵犯的場所，進而成為引起菌血癥的病灶，而菌血癥常是燒傷的致死性并發癥[1]。近年來細菌耐藥情況愈發嚴重，多重耐藥性銅綠假單胞菌檢出率持續增高，為臨床燒燙傷感染的治療帶來巨大壓力。本文自臨床分離鑒定了多重耐藥性銅綠假單胞菌并建立了該菌的燙傷小鼠感染模型，以期為進一步治療多重耐藥性銅綠假單胞菌燒燙傷感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 ICR小鼠，雌性，體重16-18g，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(吉)-2007-0003。

1.1.2 試劑 LB液體培養基胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，加ddH2O定容至1 000 ml，調節pH約為7，121℃高壓滅菌 15 min；固體營養瓊脂培養基：營養瓊脂粉33 g，加1 000 ml ddH2O，121℃高壓滅菌15 min；PCR試劑盒(TAKARA)。

1.1.3 主要實驗儀器 微量分光光度儀(酶標儀)，澳大利亞TECAN公司；紫外分光光度儀，NanoDrop公司；細菌培養箱，DHP-120型，上海實驗儀器總廠；超凈工作臺，SW-CJ-IF型，蘇州安泰技術有限公司；生物安全柜，YJ-876型，蘇州安泰技術有限公司；燙傷儀，臺式超級控溫燙傷儀：YLS-5Q型，濟南益延科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌分離鑒定及耐藥性測定 臨床燒燙傷感染創面分離純化獲得產綠色水溶性色素的銅綠假單胞菌5株，經梅里埃細菌鑒定系統鑒定，后參照何艷霞等人的文獻[2]，以5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′為引物， PCR 反應體系為50 μl，包括上、下游引物各0.4 μmol/L，模板2 μl，2 × Taq Master Mix 25 μl。反應條件為94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延長2 min，共30 個循環； 72 ℃終末延長5 min。在PCR循環條件下行菌落PCR， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并對PCR產物進行序列測定，經BlastN比對測序結果。對16sRNA序列分析后確定為銅綠假單胞菌的菌株經平板稀釋法測定其對抗菌藥物的耐藥性[3]，每種藥物濃度均設50、100、200及400 μg/ml四個濃度(表1)。選擇多重耐藥菌株制備小鼠燒傷感染模型。

1.2.2 銅綠假單胞菌擴增及濃度測定 將新鮮培養的銅綠假單胞菌溶液進行系列稀釋后，用微量分光光度儀在600 nm波長測定吸光度，并將不同吸光度的細菌溶液稀釋后涂布于普通瓊脂培養基上[4]，37℃過夜培養后，計數菌落數，計算各細菌溶液的細菌濃度(CFU/ml)，并對照原600 nm吸光度。重復實驗三次，根據三次實驗結果繪制細菌濃度及吸光度標準曲線。應用時根據濃度標準曲線，測定吸光度，調節細菌濃度。

1.2.3 小鼠燙傷模型的制備 16-18 g的ICR雌性小鼠，稱重記錄，隨機分組，每組8只。通過腹腔注射進行麻醉，麻醉劑量為0.2%戊巴比妥鈉50 μl[5]。將麻醉后的小鼠固定，露出后背4.5 cm ×1.8 cm的剃毛區域，進行脫毛處理。燙傷儀在小鼠背部皮膚較厚處，采用不同面積的平探頭進行100℃燙傷，根據面積和時間設定2.5 cm2/10 S、2.5 cm2/15 S、3.0 cm2/10S、3.0 cm2/15 S四組，燙傷后立刻用0.5 ml生理鹽水進行皮下注射，補充燙傷后滲出的組織液。觀察72 h內小鼠的活動狀況(表2)。

1.2.4 銅綠假單胞菌感染燙傷小鼠最小致死量測定 燙傷后，各組小鼠分別皮下注射濃度為1.8×1012、1.8×1011、1.8×1010、1.8×109、1.8×108、1.8×107CFU/ml 的銅綠假單胞菌菌液250 μl；對照組小鼠注射同體積的生理鹽水(表3)。將處理完的小鼠置于溫暖明亮且舒適的環境中等待其蘇醒，72 h不間斷密切觀察，記錄各組小鼠死亡數，確定皮下注射導致小鼠死亡的銅綠假單胞菌的最小濃度[6]。

2 結果

2.1 銅綠假單胞菌分離鑒定結果及耐藥性測定 分離獲得的5株產綠色水溶性色素的細菌，經16sRNA序列分析，均為銅綠假單胞菌，見圖1。5株銅綠假單胞菌均為多重耐藥菌，其中PA53對檢測的18種抗生素中的14種耐藥，4種敏感抗生素為頭孢吡肟、亞胺培南、頭孢噻肟和硫酸慶大霉素。在耐藥的14種抗生素中，除氨曲南和硫酸鏈霉素的耐受濃度為50 μg/ml外，400 μg/ml鹽酸的頭孢唑肟、頭孢米諾、頭孢呋辛、頭孢西丁鈉、鹽酸莫西沙、鹽酸左氧氟沙星等亦無法抑制PA53的生長。

圖1 16sRNA電泳結果圖

2.2小鼠燙傷模型建立2.5cm2/10s燙傷組小鼠，在72h內無死亡，且在48-72h內，滲出的組織液逐漸吸收，燙傷處的皮膚開始皺縮結痂，持續觀察至120h后亦無小鼠死亡，適合用于進行細菌燙傷感染模型的建立。而其他組別在72h內均有小鼠死亡，故選擇100℃，2.5cm2/10s燙傷刺激來制備銅綠假單胞菌感染的小鼠燙傷模型(表2)。

表1 銅綠假單胞菌耐藥性測定結果

—”表示不耐藥,數字代表耐受的藥物濃度

表2 小鼠燙傷模型建立結果

2.3 銅綠假單胞菌感染小鼠最小致死量及死亡小鼠肝臟及脾臟內細菌荷載量檢測 見表3。結果顯示感染燙傷小鼠100%死亡的PA53的最小致死量為1.8×1011CFU/ml×250 μl，可導致小鼠在48 h內死亡。最小致死量組全部死亡小鼠肝臟和脾臟的細菌負荷量分別達到1010CFU/g，108CFU/g(表4)，說明皮下注射感染的PA53可快速增殖并擴散到臟器中，細菌產生的內毒素及外毒素等使燙傷小鼠在48 h內全部死亡，病程進展快速兇險。

表3 銅綠假單胞菌感染燙傷小鼠的最小致死量測定結果

表4 最小致死量感染組死亡小鼠脾臟和肝臟的細菌濃度

3 討論

藥敏實驗中檢測的臨床常用的18種抗菌藥物中，PA53對其中14種耐藥，對12種耐藥濃度達到了400 μg/ml。其余4株銅綠假單胞菌菌株亦為多重耐藥菌株，分別對12種(PA32)、13種(PA78)、12種(PA90)、13種(PA97)抗菌藥物耐受。目前，各類臨床感染中分離的MDRPA越來越多，治療困難[7]。傳統抗菌藥物治療所面臨的困難，使開發噬菌體等生物制劑治療MDRPA感染迫在眉睫。國外已有應用噬菌體治療銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌感染燒燙傷患者的報道[6,8,9]。本實驗室在建立燙傷感染模型的同時，也在分離鑒定可高效裂解PA53的噬菌體，為進一步開發噬菌體等生物制劑治療銅綠假單胞菌燙傷感染提供基礎。

小鼠燙傷模型制備中燙傷面積及燙傷時間是參照相關文獻，并經過多次反復摸索后確定的，在72 h內燙傷小鼠可存活且具有相對良好的活動狀態，在不合并感染的情況下，5-7 d燙傷創面可以結痂并逐漸恢復，可保證后續實驗順利進行。

銅綠假單胞菌PA53，在 1.8×1011CFU/ml，250 μl的皮下注射量下，可以在48小時內導致燙傷小鼠100%的死亡量；在此感染劑量下，死亡小鼠的肝和脾內的細菌荷載量分別達到了108CFU/g和1010CFU/g數量級，說明PA53可以快速侵襲進入小鼠的組織器官并大量增殖。通過細菌內毒素、外毒素及各種酶類等作用導致燙傷小鼠在48 h內死亡，可較好的模擬進展迅速、病情兇險的臨床燒燙傷感染的病程。

[1]史紅艷，劉 克，李菁華，等.銅綠假單胞菌PA16株粘附性、菌毛與質粒關系的研究[J].微生物學雜志，2001，21(4)：35.

[2]何艷霞，向詩非，李 澆.基于16sRNA和rpoB基因的分子系統發育分析在銅綠假單胞菌鑒定匯總的應用[J].微生物學雜志， 2016， 36(4)：27.

[3]夏永祥，陳 杰.細菌耐藥性分子機制的研究進展[J].中國實驗診斷學,2010,(11):1866.

[4]McVay CS,Veláseuez M,Fralick JA.Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model[J].Antimicrobial Agent and Chemotherapy,2007,51(6),1934.

[5]Kumari S,Harjar K,Chhibber S.Topical treatment of Klebsiella pneumoniae B5055 induced burn wound infection in mice using natural productus[J].J Infect Dev Ctries,2010,4(6):367.

[6]Ahmad SI.Treatment of post-burns bacterial infections by bacteriophages,especifically unbiquitous Pseudomonas spp.notoriously resistant to antibiotics[J].Medical Hypotheses,2002,58(4):327.

[7]wang J,Hu b,Xu M ,et al.Use of bacteriophage in the treatment of experimental animal bacteremiafrom imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa[J].Int J Mol Med,2006,17(2):309.

[8]Chhibber S,Kaur S,Kumari S.Therapeutic potentialof bacteriophage in treating Klebsiella pneumoniae B5055-mediated lobar pneumonia in mice[J].J Med Microbiol,2008，57:1508.

[9]Wills QF,Kerrigan C,Soothill JS.Experimental Bacteriophage Protection against Staphylococcus aureus Abscesses in a Rabbit Model[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2005,49(3):1220.

Isolationandidentificationofmulti-drugresistantPseudomanasareuginosaandburnedmiceinfectionmodelconstruction

HAOYu-chong,LIUYang-yang,WANGYa-li,etal.

(TheBasicMedicalSchoolofJilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveIn order to isolate and identify the multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa(MDRPA) and rebuilt infection model of burned- mice by MDRPA.MethodsThe burned-mice model was rebuilt by burning instrument according to different area and time at 100℃.Pseudomonas aeruginosa was isolated and purified by the conventional method,and identified by 16sRNA sequence analysis ; The 18 kinds of anti-bacterial drugs were administrated to MDRPA by plate dilution method; Different concentrations of MDRPA were infected by subcutaneous injection to burned-mice model to measure the 100% minimum lethal dose within 72h; And the loading bacteria of spleens and livers of the dead mice in 100% minimum lethal dose infection group were tested by plate dilution method.ResultsThe multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa PA53 was selected finally,this bacterial is resistant to 14 kinds of antibiotics of all 18.The burn area and burn time were 2.5 cm2,10 s.The minimum lethal dose of PA53 to burned-mice was 1.8×1011CFU /ml,250 μl; The concentration of PA53 in liver and spleen were108PFU/g and1010PFU/g respectively.ConclusionA multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa PA53 was isolated and identified,and the burned-mice infection model was successfully constructed.The minimal lethal dose of PA53 and the bacterial loading of spleen and liver of dead mice were measured.

multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa; burned-mice model; minimum lethal dose

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1432-04

R375

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2017-03-22)