H2S對外源性LY294002預處理人結腸癌細胞凋亡的影響

李豫江 張 偉 陳志剛 黃桂林

(石河子大學醫學院第一附屬醫院普外二科，新疆 石河子 832000)

H2S對外源性LY294002預處理人結腸癌細胞凋亡的影響

李豫江 張 偉 陳志剛 黃桂林

(石河子大學醫學院第一附屬醫院普外二科，新疆 石河子 832000)

目的研究H2S對體外培養人結腸癌細胞凋亡的影響及其機制。方法體外培養人結腸癌細胞，隨機分為正常對照組、NaHS(100 μmol/L)組、LY294002(2 μg/ml)組、NaHS(100 μmol/L)+LY294002(2 μg/ml)組，采用流式細胞術檢測各組干預48 h后對人結腸癌細胞凋亡的影響，Western印跡檢測各組干預48 h后對人結腸癌細胞中磷酸化Akt、非磷酸化GSK-3β蛋白表達的影響。結果與正常對照組比較，NaHS組人結腸癌細胞凋亡顯著降低，p-Akt蛋白表達顯著增加，而GSK-3β蛋白表達顯著降低(均P<0.01)。LY294002組人結腸癌細胞凋亡顯著增加，p-Akt蛋白表達顯著降低，而GSK-3β蛋白表達均顯著增加(均P<0.01)。而與NaHS組比較，NaHS+LY294002組人結腸癌細胞凋亡顯著增加，p-Akt蛋白表達顯著降低，而GSK-3β蛋白表達顯著增加(均P<0.01)。結論PI3K/Akt/GSK-3β信號通路可能介導參與了H2S對人結腸癌細胞凋亡的抑制作用。

結腸癌細胞；硫化氫；細胞凋亡；PI3K/Akt/GSK-3β信號通路

目前結腸癌的治療方案主要還是采用手術結合放化療的綜合治療方案，但是其生存期沒有很大改善，中位生存期不足20 個月〔1，2〕。因此，研究結腸癌發生的機制，從根本上遏制其進展，對臨床上治療結腸癌，延長結腸癌的生存期具有重要意義。研究顯示內源性或外源性 H2S 在多種腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用，能調節腫瘤細胞的凋亡〔3〕。然而，H2S 是否影響結腸癌細胞的凋亡，是否參與了結腸癌的發生、發展值得關注。因此，本研究應用硫氫化鈉(NaHS)作為H2S供體處理人結腸癌細胞，探討外源性H2S 對人結腸癌細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料、試劑及儀器 人結腸癌細胞Caco-2(中科院上海細胞庫)保持了正常人結腸癌細胞基本形態和生物學特性。 高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(均為美國Gibco公司產品)，DMSO、LY294002凍干粉、NaHS(均為美國Sigma公司產品)，Annexin V-PI細胞凋亡試劑盒(美國Invitrogen公司)，兔抗人p-Akt單克隆抗體兔、抗人GSK-3β單克隆抗體(均為Cell Signaling公司)，山羊抗兔二抗(北京中杉金橋)。細胞培養箱(美國Thermo公司)，流式細胞儀(Partec公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，電泳槽(美國Bio-Rad公司)，凝膠電泳成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2細胞培養 人結腸癌細胞復蘇后用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基于5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養，當細胞生長至70%～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續培養，細胞傳代周期穩定后即可用于實驗。

1.3實驗分組 收集人結腸癌細胞，計數后接種于培養板中，待細胞完全貼壁后，棄完全培養基，加入無血清DMEM培養液同步化24 h，按實驗要求分為正常對照組、NaHS(100 μmol/L)組、LY294002(2 μg/ml)組、NaHS+LY294002組，每組均干預培養48 h。

1.4流式細胞術檢測各組人結腸癌細胞凋亡情況 收集對數期生長的人結腸癌細胞以2×105個/ml接種于6 孔培養板中，每孔2 ml，按照分組給予不同的處理因素，干預48 h后，收集各組人結腸癌細胞，嚴格按照Annexin V-PI雙染法細胞凋亡試劑盒操作步驟，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.5Western印跡檢測各組p-Akt、GSK-3β蛋白表達情況 收集對數期生長的人結腸癌細胞以1×106個/ml接種于6 孔培養板中，每孔2 ml，按照分組干預培養48 h 后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入細胞裂解液，4℃靜置20 min，12 000 r/min 離心25 min，取上清，統一蛋白濃度為20 g/L，蛋白變性后待用。蛋白經10%SDS-PAGE 凝膠分離后，采用半干轉法轉膜，然后經5%BSA封閉后，分別加兔抗人p-Akt一抗(1∶1 000)，兔抗人GSK-3β(1∶1 500)一抗,4℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗(1∶30 000)，室溫搖床上孵育3 h，TBST洗膜后加入化學發光試劑曝光，顯影、定影后將膠片置于凝膠成像分析進行定量分析。用同樣方法檢測β-actin內參蛋白的表達。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組人結腸癌細胞凋亡情況 與正常對照組〔(3.22±0.57)%〕比較，NaHS組細胞凋亡率顯著降低〔(0.67±0.27)%，P<0.01〕，LY294002組〔(10.03±0.89)%〕、NaHS+LY294002組〔(6.74±0.96)%〕細胞凋亡率均顯著增加(P<0.01)。與NaHS組比較，LY294002組、NaHS+LY294002組細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)，與LY294002組相比，NaHS+LY294002組細胞凋亡率顯著減少(P<0.01)。

2.2各組人結腸癌細胞中p-Akt、GSK-3β蛋白表達情況 見表1，圖1。與正常對照組比較，NaHS組人結腸癌細胞中p-Akt蛋白表達顯著增加，GSK-3β蛋白表達顯著減少，LY294002組人結腸癌細胞中p-Akt蛋白表達顯著降低，GSK-3β蛋白表達顯著增加(均P<0.01)，NaHS+LY294002組人結腸癌細胞中p-Akt蛋白表達顯著降低，GSK-3β蛋白表達顯著增加(均P<0.01)；與NaHS組比較，LY294002組人結腸癌細胞中p-Akt蛋白表達顯著降低，GSK-3β蛋白表達顯著增加(均P<0.01)，NaHS+LY294002組人結腸癌細胞中p-Akt蛋白表達顯著降低，GSK-3β蛋白表達顯著增加(均P<0.01)；與LY294002組比較，NaHS+LY294002組人結腸癌細胞中p-Akt蛋白表達顯著增加，GSK-3β蛋白表達顯著降低(P<0.01)。

表1 各組人結腸癌細胞中p-Akt、GSK-3β蛋白表達情況

與正常對照組比較:1)P<0.01；與NaHS組比較:2)P<0.01；與LY294002組比較:3)P<0.01

1～4：正常對照組、NaHS組、LY294002組、NaHS+LY294002組圖1 各組p-Akt、GSK-3β蛋白表達

3 討 論

近些年研究發現，氣體信號分子NO和CO在結腸癌的發生、發展中發揮著重要的作用，其與結腸癌的增殖、凋亡和遷移密切相關，參與了結腸癌的增殖、凋亡和遷移〔4,5〕。然而H2S作為第3種氣體信號分子，廣泛分布于心血管、內臟和神經系統〔6〕。研究發現：H2S能夠促進結腸癌細胞的增殖〔7〕，但其是否參與結腸癌的發生與發展、對結腸癌細胞凋亡的影響如何尚未見報道。本文結果顯示NaHS可顯著抑制人結腸癌細胞的凋亡。研究發現，磷脂酰肌醇-3(PI3K)/蛋白激酶(Akt)信號通路是細胞存活、增殖及凋亡過程中較為關鍵的通路，該通路被持續激活可促進細胞增殖,抑制細胞凋亡反之，該通路被持續阻斷，可抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡〔8〕。該通路活化的機制是由PI3K通過與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體相互作用，然后通過Ras和p110直接結合導致其活化，活化的PI3K促使PDK1磷酸化的Ser308導致Akt活化，活化的Akt可使磷酸化GSK-3β蛋白表達增加，而非磷酸化GSK-3β蛋白表相對減少，從而激活Bax、Bcl-2家族成員，調節細胞線粒體內多種凋亡相關蛋白的釋放，最終抑制細胞的凋亡。LY294002作為PI3K特異性阻滯劑，可特異性阻斷PI3K/Akt信號通路，從而抑制下游蛋白表達而誘導細胞凋亡〔9〕。本實驗說明NaHS對人結腸癌細胞凋亡的調控可能是通過激活PI3K/Akt信號通路而實現的，當運用PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路后，NaHS能明顯促進人結腸癌細胞的凋亡，這進一步支持NaHS對人結腸癌細胞凋亡的調控可能是通過PI3K/Akt信號通路而實現的。

1Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2009;59(4):225-49.

2Roper J,Richardson MP,Wanq WV,etal.The dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 induces tumor regression in a genetically engineered mouse model of PIK3CA wild-type colorectal cancer〔J〕.PLoS One，2011;6(9):e25132.

3Wu YC，Wang XJ，Yu L，etal.Hydrogen sulfide lowers proliferation and induces protective autophagy in colon epithelial cells〔J〕.PLoS One，2012;7(5):e37572.

4Bocca C,Bozzo F,Bassignana A,etal.Antiproliferative effect of a novel nitro-oxy derivative of celecoxib in human colon cancer cells:role of COX-2 and nitric oxide〔J〕.Anticancer Res,2010;30(7):2659-66.

5Babykutty S,Suboj P,Srinivas P,etal.Insidious role of nitric oxide in migration/invasion of colon cancer cells by upregulating MMP-2/9 via activation of cGMP-PKG-ERK signaling pathways〔J〕.Clin Exp Metastasis,2012;29(5):471-92.

6于 芳，趙 晶，唐朝樞，等.自行合成硫化氫緩釋供體 GYY4137 對細胞活力的影響及其釋放的硫化氫在小鼠體內的分布〔J〕.北京大學學報(醫學版)，2010;42(5):493-7.

7洪 敏，唐小卿，何 葵，等.硫化氫對人結腸癌細胞增殖和遷移的影響〔J〕.南方醫科大學學報，2014;34(5):699-703.

8Mori H,Inoki K,Masutani K,etal.The mTOR pathway is highly activated in diabetic nephropathy and rapamycin has a strong therapeutic potential〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2009;384(4):471-5.

9Park SJ，Sohn HY，Yoon J，etal.Down-regulation of FoxO-dependent c-FLIP expression mediates TRAIL-induced apoptosis in activated hepatic stellate cells〔J〕.Cell Signal，2009;21(10):1495-503.

〔2016-05-18修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R656.9

A

1005-9202(2017)18-4502-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.031

黃桂林(1961-)，男，醫學博士，主任醫師，碩士生導師，主要從事結直腸腫瘤發生機制研究。

李豫江(1970-)，男，醫學碩士，副主任醫師，主要從事結直腸腫瘤發生機制研究。