鱉源嗜水氣單胞菌的耐藥性研究

朱凝瑜，鄭曉葉，曹飛飛，李楊陽，鄭天倫

(浙江省水產技術推廣總站， 浙江 杭州 310023)

鱉源嗜水氣單胞菌的耐藥性研究

朱凝瑜，鄭曉葉，曹飛飛，李楊陽，鄭天倫*

(浙江省水產技術推廣總站， 浙江 杭州 310023)

對10株分離自患病中華鱉的嗜水氣單胞菌進行了耐藥性研究。藥敏試驗結果表明，這10株嗜水氣單胞菌呈現相近的耐藥譜，對阿米卡星、新霉素、頭孢哌酮、氨曲南、多西環素、諾氟沙星、恩諾沙星等7種藥物均敏感，對青霉素G、林可霉素、萬古霉素、甲氧嘧啶等4種藥物耐藥，對氟苯尼考、四環素、復方新諾明產生了不同的耐藥性。同時對qnrA、qnrB、qepA等17種耐藥基因進行檢測，10株菌均檢測到了2～11種耐藥基因，檢出率最高的耐藥基因為qnrA與cat1，達到了100%，而qepA、aph(3′)、sulⅡ、sulⅢ、OXA等5個基因未檢出。同種細菌不同分離株表現出不同的耐藥性，提示用藥時有必要針對病原進行藥敏試驗，篩選敏感藥物進行疾病防治。

中華鱉；嗜水氣單胞菌；藥敏試驗；耐藥基因

中華鱉(Pelodiscussinensis)是浙江省最重要的水產養殖品種之一，對全省漁業經濟和漁民增收作出了重要貢獻。據統計，2015年浙江省中華鱉養殖產量達到13.3萬t。隨著養殖的快速發展和集約化程度的不斷提高，中華鱉在養殖過程中發病日趨增多，給養殖業帶來了巨大的經濟損失[1]。細菌性疾病作為中華鱉養殖過程中的主要病害種類，發病范圍廣，持續時間長，危害程度大。對細菌性疾病的防治主要依賴各種抗菌性藥物，但隨著時間推移，細菌逐漸對常見抗菌藥物產生了耐藥性[2]，因此近年來使用抗菌藥物防治中華鱉細菌病的效果不盡如人意。為摸清浙江省中華鱉主要病原菌的耐藥性現狀，正確指導用藥，減少藥物殘留風險，以中華鱉最常見也最主要的病原菌——嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，AH)為代表，對其耐藥性開展了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗜水氣單胞菌10株(后簡稱AH1～10)，由本實驗室分離自浙江省內有關中華鱉養殖場，其中AH1、AH2采自海寧某養殖場，AH3采自海鹽，AH4～AH8采自杭州某2個養殖場，AH9采自德清，AH10采自蘭溪。經VITEK2-Compact全自動細菌鑒定、藥敏分析儀鑒定及16s rRNA測序確認為嗜水氣單胞菌。

腦心浸液培養基(BHI)購自青島海博微生物公司。阿米卡星、新霉素、青霉素G、頭孢哌酮、氨曲南、氟苯尼考、四環素、多西環素、林可霉素、萬古霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、甲氧嘧啶和復方新諾明等14種藥敏紙片購自杭州微生物有限公司。

PCR擴增引物由生工生物工程技術服務(上海)有限公司合成。Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR試劑(10×PCR 緩沖液，10 mmol·L-1dNTP，Taq酶，滅菌雙蒸水，25 mmol·L-1的MgCl2)、瓊脂糖、50×TAE的電泳緩沖液、80 ng·μL-1的DNA marker 2000、6×loading buffer、核酸染料等購自生工生物工程技術服務(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥敏試驗

采用常規紙片擴散(K-B)法[3]，在BHI培養基上進行8類14種常用抗菌藥物的抗菌敏感性測定，經28 ℃恒溫培養24 h后，測量抑菌圈大小。每種藥物對每株細菌均設3個平行試驗組，根據其抑菌圈直徑大小的平均值，參照NCCLS的判斷標準[4]判定各藥物對細菌的藥效。

1.2.2 耐藥基因測定

用Ezup柱式細菌基因組抽提試劑盒對10株嗜水氣單胞菌進行DNA提取，再PCR檢測17種耐藥基因。耐藥基因引物序列如表1所示。

表1嗜水氣單胞菌耐藥性基因檢測引物

Table1PCR primers used to amplify antimicrobial resistant genes ofAeromonashydrophila

目的基因Targetgenes引物序列Primersequences上游引物Forwordprimers下游引物ReverseprimersqnrAATTTCTCACGCCAGGATTTGGATCGGCAAAGGTCAGGTCAqnrBGATCGTGAAAGCCAGAAAGGACGATGCCTGGTAGTTGTCCqepAGCAGGTCCAGCAGCGGGTAGCTTCCTGCCCGAGTATCGTGqnrSGCAAGTTCATTGAACAGGGTTCTAAACCGTCGAGTTCGGCGfloRCCCGCTATGATCCAACTCACACCCACATCGGTAGGATGAAaph(3')TGACTGGGCACAACAGACAACGGCGATACCGTAAAGCACant(3″)ATCTGGCTATCTTGCTGACATATGACGGGCTGATACTGGaac(6')-ⅠATGACCTTGCGATGCTCTATGACGAATGCCTGGCGTGTTTaac(3)-ⅠACCCTACGAGGAGACTCTGAATGCCAAGCATCGGCATCTCATAsulⅠCATTGCCTGGTTGCTTCATATCCGACTCGCAGCATTTsulⅡCATCATTTTCGGCATCGTCTCTTGCGGTTTCTTTCAGCsulⅢAGATGTGATTGATTTGGGAGCTAGTTGTTTCTGGATTAGAGCCTcmlAGTTGGCGGTACTCCCTTGCCGGCCACCTCCCAGTAGAACGcatBCCSAAYATCAARGTWGGGCGGGCATGAYCATRGCCTCMGAcat1TCTTGCCCGCCTGATGAATGCAACCTGAATCGCCAGCGGCATEMATGAGTATTCAACATTTTCGTGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGOXACTGTTGTTTGGGTTTCGCAAGCTTGGCTTTTATGCTTGATG

PCR反應總體積為25 μL，包括DNA模板2.0 μL，10×Buffer PCR 緩沖液2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 mol·L-1細菌各耐藥基因引物各0.5 μL， 5 U·μL-1的Taq酶0.3 μL，然后用滅菌雙蒸水ddH2O補充至25 μL。PCR 反應參數：預變性94 ℃ 10 min，然后94 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃復性50 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

2 結果與分析

2.1 藥敏試驗

10株嗜水氣單胞菌的藥敏試驗結果見表2。結果顯示這10株菌呈現出明顯的耐藥性，耐藥率分別為青霉素G 100%、林可霉素100%、萬古霉素100%、甲氧嘧啶100%、復方新諾明40%、氟苯尼考10%、四環素10%。

10株嗜水氣單胞菌的耐藥譜大致相近，均對青霉素G、林可霉素、萬古霉素、甲氧嘧啶等4種藥物耐藥，而對阿米卡星、新霉素、頭孢哌酮、氨曲南、多西環素、諾氟沙星、恩諾沙星等7種藥物敏感。但在氟苯尼考、四環素、復方新諾明等3種藥物上，產生了不同的耐藥性：菌株AH1～9對氟苯尼考、四環素敏感，而AH 10耐藥；菌株AH3、5～9對復方新諾明敏感，而AH1、2、4、10則耐藥。

耐藥頻數分析表明，嗜水氣單胞菌分離株均對1種或多種抗生素耐藥。其中6 株對4 種抗生素耐藥，占60%；3 株對5 種抗生素耐藥，占30%；1 株對7 種抗生素耐藥，占10%。

2.2 耐藥基因檢測

對10株嗜水氣單胞菌的17個耐藥基因進行了PCR擴增檢測，所有10株菌均檢測到了耐藥基因，數量2～11個不等(表3)，其中菌株AH10含耐藥基因最多達11種；菌株AH1與AH2、AH4相同，含耐藥基因5個；菌株AH5與AH6、7、8所含耐藥基因相同，為3個；菌株AH10所含耐藥基因與其他菌株差異性較大。

耐藥基因中，檢出率最高的為qnrA與cat1，達到了100%，qnrS也較高為80%，sulⅠ檢出率為50%，qnrB、floR、cmlA、catB、ant(3″)、aac(6′)-I、aac(3)-I、TEM檢出率10%～30%，qepA、aph(3′)、sulⅡ、sulⅢ、OXA等5個基因未檢出。

3 討論

嗜水氣單胞菌屬弧菌科氣單胞菌屬，廣泛分布于自然界的各種水體，屬于條件致病菌，是魚類、兩棲類、爬行類和哺乳類動物最主要的致病菌之一[5-6]。對于中華鱉，嗜水氣單胞菌感染可引起紅脖子病、紅底板病、穿孔病、腐皮病、白底板病等多種疾病，危害極大[7-12]。

表2十株嗜水氣單胞菌的藥物敏感性

Table2Antimicrobial susceptibility of 10Aeromonashydrophilastrains

藥物類別Category藥物名稱Drug藥物敏感性AntimicrobialsusceptibilityAH1AH2AH3AH4AH5AH6AH7AH8AH9AH10耐藥率Resistancerate/%氨基糖苷類阿米卡星AmikacinSSSSSSSSSS0Aminoglycoside新霉素NeomycinSSSSSSSSSS0β-內酰胺類β-Lactam青霉素GPenicillinGRRRRRRRRRR100頭孢哌酮CefoperazoneSSSSSSSSSS0氨曲南AztreonamSSSSSSSSSS0氯霉素類Chloramphenicol氟苯尼考FlorfenicolSSSSSSSSSR10四環素類四環素TetracyclineSSSSSSSSSR10Tetracyclines多西環素deoxytetracyclineSSSSSSSSSS0林可酰胺類Lincosamides林可霉素LincomycinRRRRRRRRRR100多肽類Polypeptide萬古霉素VancomycinRRRRRRRRRR100喹諾酮類Quinolones諾氟沙星NorfloxacinSSSSSSSSSS0恩諾沙星EnrofloxacinSSSSSSSSSS0磺胺類Sulfonamides復方新諾明SMZ-TMPRRSRSSSSSR40甲氧嘧啶SulfamethoxydiazineRRRRRRRRRR100

R為耐藥；S為敏感。

R， resistant; S， sensitive.

表3十株嗜水氣單胞菌的耐藥基因檢測結果

Table3Results of antimicrobial resistant genes detected in 10Aeromonashydrophilastrains

耐藥基因Antimicrobialresistentgenes試驗菌株BacterialstrainsAH1AH2AH3AH4AH5AH6AH7AH8AH9AH10檢出率Resistancerate/%喹諾酮類qepA----------0QuinolonesqnrS++-+++++-+80qnrA++++++++++100qnrB--------+-10氯霉素類floR---------+10ChloramphenicolcmlA---------+10cat1++++++++++100catB---------+10氨基糖苷類aph(3')----------0Aminoglycosideant(3″)---+-----+20aac(6')-I++-------+30aac(3)-I---------+10磺胺類sulⅠ++-+----++50SulfonamidessulⅡ----------0sulⅢ----------0β-內酰胺類TEM---------+10β-LactamOXA----------0合計Total55253333411

“+”表示檢測到該基因，“-”表示未檢測到該基因。

“+” meant the gene was detected; “-” meant the gene was not detected.

抗菌藥物治療仍然是防治細菌性疾病的最主要手段之一。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，導致嗜水氣單胞菌的耐藥性呈增長趨勢，并產生了多重耐藥性菌株[2]，給水生動物嗜水氣單胞菌病的防治帶來了新的難題和挑戰，同時嚴重影響水產動物源性食品的質量安全。

本次藥敏試驗表明，浙江省內分離的這10株鱉源嗜水氣單胞菌均呈多重耐藥，其中6株對4類抗生素中的4種藥物產生耐藥性，占60%；3株對4類抗生素中的5種藥物耐藥，占30%；1株對6類抗生素中的7種抗生素耐藥，占10%。10株細菌呈現相近的耐藥譜：均對青霉素G、林可霉素、萬古霉素、甲氧嘧啶等耐藥；對阿米卡星、新霉素、頭孢哌酮、氨曲南、多西環素、諾氟沙星、恩諾沙星等7種藥物敏感；但在氟苯尼考、四環素、復方新諾明等3種藥物上，分離自蘭溪的AH10與其他杭嘉湖菌株產生了較強的差異性，AH10對這3種藥均耐藥，而其他幾乎均為敏感，呈現出一定的地域性，這可能與菌株本身以及各地區用藥習慣不同有關。同種細菌的不同分離株由于地域及所處環境不同，對藥物的敏感性也可能不同，因此在生產過程中，“對癥下藥”并不嚴謹，有必要針對病原進行藥敏試驗，篩選敏感藥物進行疾病防治，在提高治療效果的同時，也可避免因亂用、濫用藥物造成的藥物殘留超標和環境污染等問題。

喹諾酮類耐藥基因qnr能編碼蛋白保護DNA螺旋酶上喹諾酮作用位點，使其免受藥物損傷，減少藥物敏感性[13]；qepA屬于外排泵機制，可將細胞質和細胞膜內的藥物排出，從而增加耐藥性[14]。氯霉素類耐藥基因cat基因調控合成乙?；D移酶使氯霉素類藥物不能與細菌的核糖體結合從而缺乏抗菌活性；cmlA基因與floR則與外排機制有關[15]。乙酰轉移酶(aac)、核苷轉移酶(ant)、磷酸轉移酶(aph)均為修飾(鈍化)酶，經酶修飾的抗生素與細菌16S rRNA上位點的結合力下降從而導致藥物抗菌活性的喪失[16]。sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ編碼對磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶，降低藥物結合力[17]。TEM、 OXA均為β內酰胺酶，可水解破壞進入菌體內的β-內酰胺類抗生素[18]。這17種耐藥基因的檢測結果表明，所有菌株均含有2～11個數量不等的耐藥基因，其中檢出率最高的為qnrA與cat1，達到了100%，qnrS也有較高的檢出率(80%)，而qepA、aph(3′)、sulⅡ、sulⅢ、OXA等5種基因未檢出。攜帶耐藥基因的現象普遍存在，且多含有2種及以上耐藥基因，預示著可能存在出現超級耐藥細菌的風險，必須對病原菌的耐藥性加以高度重視。

細菌耐藥性與其本身特性、耐藥基因、藥物的常規使用情況等因素有關[19]，其中細菌耐藥性的流行與耐藥基因的存在有很大關系[20]。綜合藥敏試驗、耐藥基因的檢測結果表明，含耐藥基因數量較多的菌株其耐藥譜也相對較廣；氟苯尼考耐藥基因floR陽性的菌株AH10相應的對氟苯尼考耐藥；磺胺類耐藥基因sulⅠ陽性的菌株與對復方新諾明的耐藥性也幾乎一致，說明耐藥基因的存在會使菌株產生相應的耐藥性。但并未產生一一對應關系，也存在對某種藥物敏感的菌株卻擴增出相應耐藥基因的情況，如喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrS均有較高的檢出率，但菌株卻對喹諾酮類藥物敏感；或者存在同樣擴增結果為陽性卻表現出不同耐藥性的菌株，如sulⅠ陽性的菌株AH 5在復方新諾明的耐藥性上與其他該基因陽性菌株相反。這可能與耐藥基因間的相互影響、基因的表達程度、不同藥物的抗菌性能、表達蛋白酶的穩定性差異有關。后續將對耐藥基因進行測序分析，對陽性基因是否存在差異以及其與耐藥性是否存在直接相關性進行研究，并逐步開展耐藥基因相互作用以及表達蛋白酶穩定性等研究，為更好地闡明鱉源嗜水氣單胞菌耐藥性產生機制提供參考。

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(責任編輯盧福莊)

AntimicrobialresistanceofAeromonashydrophilaisolatedfromsoft-shelledturtlePelodiscussinensis

ZHU Ningyu， ZHENG Xiaoye， CAO Feifei， LI Yangyang， ZHENG Tianlun*

(ZhejiangFisheriesTechnicalExtensionCenter，Hangzhou310023，China)

The antimicrobial resistance of 10Aeromonashydrophilastrains collected from diseased soft-shelled turtlePelodiscussinensiswas studied in this paper. Drug sensitive tests showed that all the 10 strains were sensitive to Amikacin， Neomycin， Cefoperazone， Aztreonam， Deoxytetracycline， Norfloxacin， Enrofloxacin and were risistent to Penicillin G， Lincomycin， Vancomycin， Sulfamethoxydiazine， but they showed different susceptibility to Florfenicol， Tetracycline， SMZ-TMP. At the same time， 17 antimicrobial resistant genes in the 10 strains were detected by PCR. The results showed that all these 10 strains carried 2-11 resistance genes. The highest detection rate of resistant geneqnrAandcat1 reached 100% ， whileqepA,aph(3′),sulⅡ,sulⅢ,OXAwere not detected. DifferentAeromonashydrophilastrains showed different antimicrobial resistance， suggesting that it was necessary to carry out drug sensitivity tests before treating and preventing.

Pelodiscussinensis;Aeromonashydrophila; drug sensitive tests; antimicrobial resistant gene

S941.42；S947.1+2

：A

：1004-1524(2017)09-1445-06

朱凝瑜，鄭曉葉，曹飛飛，等. 鱉源嗜水氣單胞菌的耐藥性初步研究[J].浙江農業學報，2017，29(9): 1445-1450.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.04

2017-02-16

浙江省重大科技專項重點農業項目(2015C02028-1)；浙江省水產品質量安全技術支撐團隊項目(QS2016014)

朱凝瑜(1984—)，女，浙江長興人，碩士，工程師，從事水產養殖病害研究。E-mail：zny1984@sina.com

*通信作者，鄭天倫，E-mail: nballan@163.com