汞離子對草魚抗氧化功能的影響

牛景彥，劉占才，2，*

(1.焦作師范高等專科學校 生物技術研究所，河南 焦作 454001； 2.河南師范大學 水產學院，河南 新鄉453007)

汞離子對草魚抗氧化功能的影響

牛景彥1，劉占才1，2，*

(1.焦作師范高等專科學校 生物技術研究所，河南 焦作 454001； 2.河南師范大學 水產學院，河南 新鄉453007)

試驗將草魚分為對照組和處理組，對照組置于正常養殖用水中飼養，處理組暴露在Hg2+濃度為0.07、0.22、0.37、0.52 mg·L-1水體中。各組分別于飼養1、5、12、21 d取樣，測定鰓、肝胰臟、脾臟和腎臟組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)活性、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。結果顯示：與對照組相比，整個試驗期內，各組織器官中的SOD、GPx活性(0.52 mg·L-1組)以及GSH含量(0.37、0.52 mg·L-1組)均顯著降低(P<0.05)，MDA含量(0.37、0.52 mg·L-1組)顯著增加(P<0.05)。暴露1 d時，各組織器官中的SOD、GPx活性(0.07、0.22、0.37 mg·L-1組)和GSH的含量(0.07、0.22 mg·L-1組)均有不同程度的升高，鰓中的MDA含量(0.07、0.22 mg·L-1組)顯著下降(P<0.05)。暴露5 d時，0.37 mg·L-1組鰓、脾臟、腎臟中的SOD活性，鰓、肝胰臟、腎臟中的GPx活性，各組織器官中的GSH含量均顯著下降(P<0.05)。暴露12 d時，各組織器官中SOD和GPx活性(0.37 mg·L-1組)均顯著下降。暴露21 d時，各組織器官中SOD和GPx活性(0.22、0.37 mg·L-1組)以及脾臟和腎臟中的GSH含量(0.22 mg·L-1組)均顯著下降(P<0.05)，各組織器官中的MDA含量(0.22 mg·L-1組)均顯著增加(P<0.05)。結果表明，低濃度短時間暴露Hg2+對草魚抗氧化能力有促進作用，高濃度長時間暴露則具有抑制作用；各組織器官對Hg2+的應激反應和各抗氧化組分對Hg2+的應激反應均不盡相同，這可能與臟器和抗氧化組分自身的特點有關，同時也反映出Hg2+毒性作用的復雜性。

Hg2+；草魚；抗氧化功能

隨著我國經濟的高速發展，能源、資源的快速消耗，大量含汞廢物被排放到環境中，最終隨著水循環進入水體[1]。人類活動造成的水體汞污染，已經嚴重影響了水生生物的生長和發育，甚至導致了水生生物的大量死亡，直接或間接地影響人類的食品安全和健康。近年來，魚類在評價污染物對生態系統的影響方面的應用越來越多。Almoroth等[2]認為在評價外源污染物對魚類的影響時，需綜合考慮抗氧化機制的響應。Padmini等[3]發現，汞能夠誘發魚體內活性氧自由基(ROS)的產生，引起魚體抗氧化能力的變化，故其抗氧化功能的變化可以作為汞脅迫的重要指標。雖然許多學者在汞對魚類抗氧化能力的影響方面開展了研究，但多以個別抗氧化因子作為指標進行評價，少見對魚類抗氧化能力進行系統的研究[4-6]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)是魚體內重要的抗氧化酶， 其活性的變化直接影響細胞內ROS和其終末產物脂質過氧化物(LPO) 的含量。還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)是動物體內重要的抗氧化劑，作為GPx的底物，在動物體內抗氧化代謝中具有重要作用。丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量可以直接反映細胞的脂質過氧化水平和機體受損傷的程度。草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國重要的淡水養殖經濟魚種，用以作為試驗動物具有很好的代表性。本試驗以草魚為供試動物，研究了汞暴露情況下草魚鰓、肝胰臟、脾臟和腎臟組織中SOD、GPx活性，以及GSH和MDA含量的變化，旨在探討汞污染對草魚抗氧化功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗草魚購自新鄉市郊某魚種場，體長(15±2)cm，體質量(110±10)g；置于塑料水箱(100 cm×50 cm×40 cm)中暫養7 d后，挑選體格健壯，規格齊整的草魚隨機分組，進行試驗。

HgCl2，分析純，用雙蒸餾水配制成Hg2+濃度為100 mg·L-1母液，根據試驗需要稀釋成所需濃度。SOD、GPx、GSH、MDA和蛋白質檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理

采用改進的寇氏法[7]，進行急性毒性實驗，計算出Hg2+對草魚96 h的半致死濃度(LC50)為0.67 mg·L-1。以此為依據，設置 4 個處理組(0.07、0.22、0.37、0.52 mg·L-1)及1個空白對照組，每組50尾草魚。試驗用水為充氧曝氣的自來水。養殖水體為：每箱注水100 L，水溫26～28 ℃，溶解氧為>5 mg·L-1，pH值為7～8。試驗采用靜態置換法，每天更換試驗水體，各組在整個試驗期內，正常投喂。每組2個重復，分別于暴露1、5、12、21 d時取樣，每次隨機取魚10尾，取鰓、肝胰臟、脾臟和腎臟等組織待測。

1.2.2 樣品處理

在冰水浴條件下，用4 ℃ 0.65% NaCl溶液清洗鰓、肝胰臟、脾臟和腎臟，濾紙吸干，稱重，按0.1 g組織加1 mL 4 ℃ 0.65% NaCl溶液的比例，用玻璃勻漿器冰浴勻漿，并于4 ℃，12 000g離心10 min，將上清液保存于-20 ℃冰箱中待測。

1.2.3 抗氧化酶活性測定

SOD、GPx測定均按試劑盒說明進行。SOD 活性(λSOD)單位定義：每毫克組織蛋白在 1 mL 反應液中 SOD 抑制率達 50%時所對應的 SOD 量為一個 SOD 活性單位(U)。GPx活性(λGPx)單位定義：每毫克蛋白催化1微摩爾GSH 所需的GPx的量為一個GPx活性單位(U)。

1.2.4 GSH和MDA含量測定

GSH、MDA測試方法按試劑盒說明進行。GSH 含量定義：每克組織蛋白中GSH的含量(mg·g-1protein)。MDA 含量定義：每毫克組織蛋白中MDA的含量(μmol·mg-1protein)。所有指標吸光值均用 UV-2550 紫外可見分光光度計(日本島津公司)測定。

1.3 數據處理

所有結果均以平均值±標準差來表示，用SPSS15.0 統計軟件對所得數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平設定為P<0.05。

2 結果與分析

2.1不同濃度Hg2+對SOD活性的影響

從圖1可以看出：與對照組相比，暴露1 d，0.07、0.22、0.37 mg·L-1組各器官組織中SOD活性在Hg2+的誘導作用下均有不同程度的升高，隨著暴露時間的延長，活性降低；暴露21 d，0.07mg·L-1組SOD活性回落至與對照組相當水平，0.22、0.37 mg·L-1組SOD活性均顯著下降(P<0.05)。在整個實驗期內，0.52 mg·L-1組各器官組織中SOD活性均受到顯著抑制(P<0.05)。

* 表示與對照組差異顯著(P<0.05)。下同* meant significant difference at the level of P<0.05 in comparison to control group. The same as below.圖1 Hg2+對草魚器官中SOD活性的影響Fig.1 Effect of Hg2+ on SOD activities in organs of Ctenopharyngodon idella

2.2不同濃度Hg2+對GPx活性的影響

Hg2+對草魚器官GPx活性的影響見圖2。與對照組相比，0.07、0.22、0.37 mg·L-1組GPx活性不同程度地表現為先升后降；暴露1 d，3組各組織器官中GPx活性均有不同程度的升高；暴露5 d，0.37 mg·L-1組肝胰臟、脾臟和腎臟中GPx活性顯著下降(P<0.05)；暴露12 d，0.22 mg·L-1組鰓中GPx活性顯著下降(P<0.05)，0.37 mg·L-1組各組織器官中GPx活性均顯著下降(P<0.05)；暴露21 d，0.22、0.37 mg·L-1組各組織器官中GPx活性均受到顯著抑制(P<0.05)。在整個試驗期內，0.52 mg·L-1組各器官組織中GPx活性均受到顯著抑制(P<0.05)。

2.3不同濃度Hg2+對GSH含量的影響

從圖3可以看出：與對照組相比，暴露1 d，0.07、0.22 mg·L-1組各組織器官中GSH含量表現為不同程度的增高；暴露21 d，0.07 mg·L-1組各組織器官和0.22 mg·L-1組鰓、肝胰臟中GSH含量降低至與對照組相當水平，而0.22 mg·L-1組脾臟和腎臟中GSH含量顯著下降(P<0.05)。在試驗期內，0.37、0.52 mg·L-1組各組織器官中GSH含量顯著下降(P<0.05)。

2.4不同濃度Hg2+對MDA含量的影響

Hg2+對草魚器官MDA含量的影響見圖4。可以看出：暴露1 d，0.07、0.22 mg·L-1組鰓中MDA含量顯著下降(P<0.05)。暴露21 d，0.07 mg·L-1組各器官組織中MDA含量均與對照組無顯著變化(P>0.05)；0.22 mg·L-1組各器官組織中MDA含量均顯著升高(P<0.05)。在試驗期內，0.37、0.52 mg·L-1組各組織器官中MDA含量均顯著升高(P<0.05)。

3 討論

在正常生理狀態下，由于SOD、GPx、GSH等構成的抗氧化系統的作用，機體能夠清除正常代謝時產生的ROS，從而維持體內氧化還原狀態的動態平衡。研究表明，重金屬對生物體的毒性作用是通過改變機體抗氧化系統組分的活性或含量，誘導機體產生過量的ROS，打破機體內固有的氧化還原平衡狀態來實現的[8]。本試驗中，Hg2+暴露使各組織器官中SOD、GPx活性和GSH含量均發生了不同程度的變化，也從一個側面證實了這一結論。當機體內ROS激增時，會引起機體的氧化應激反應。在ROS的誘導及機體的代償應激下，細胞會誘導性地增強抗氧化能力，一般會出現一個過程性的抗氧化酶活性的升高或還原性物質含量的增加現象，這一現象被稱為“毒物興奮作用”[9]。Huang等[10]在研究汞暴露對牙鲆(Paralichthysolivaceus)體內SOD、GPx活性的影響時，也得出了類似的結果。這與本試驗中，暴露1 d，0.07、0.22、0.37 mg·L-1組各組織器官中SOD、GPx活性，以及0.07、0.22 mg·L-1組GSH含量升高的現象是一致的。但隨著大量ROS對抗氧化系統的消耗，以及細胞代償作用的減弱，抗氧化酶活性或還原性物質含量會很快降低，與較高濃度的ROS保持新的動態平衡[11]。這可能是0.07 mg·L-1組SOD、GPx活性和GSH含量隨暴露時間的延長先升后降，以及0.07、0.22 mg·L-1組肝胰臟、脾臟和腎臟中此3項指標在暴露1 d時均升高，而相對應的MDA含量卻沒有顯著變化的原因。但隨著暴露時間的延長和濃度的增加，各組織器官中蓄積的Hg2+對SOD、GPx活性的影響超出了各組織器官的自我修復能力，新的動態平衡被打破[12]，致使各組織器官中的SOD、GPx活性顯著受到抑制。有研究發現，GSH可以直接與生物體內的Hg2+和ROS結合，起到解毒作用，從而被不斷消耗[13-14]。因此，推測高濃度Hg2+暴露下，草魚組織內過量的Hg2+、ROS對GSH造成大量消耗，從而導致了0.37、0.52 mg·L-1組在整個實驗期內各組織器官中GSH含量的顯著下降。

圖2 Hg2+對草魚器官中GPx活性的影響Fig.2 Effect of Hg2+ on GPx activities in organs of Ctenopharyngodon idella

圖3 Hg2+對草魚器官中GSH含量的影響Fig.3 Effect of Hg2+ on GSH contents in organs of Ctenopharyngodon idella

圖4 Hg2+對草魚器官中MDA含量的影響Fig.4 Effect of Hg2+ on MDA contents in organs of Ctenopharyngodon idella

邢桂芳等[15]認為，在高濃度或長時間的暴露下，重金屬對生物體抗氧化能力的抑制作用超出自身的修復能力時，會致使體內發生脂質過氧化損傷，導致MDA呈現不斷升高。這與本試驗中，0.22 mg·L-1組暴露21 d，0.37、0.52 mg·L-1組在整個試驗期內MDA含量均顯著升高的試驗結果相一致。值得注意的是，0.37 mg·L-1組在暴露1 d時，肝胰臟、脾臟和腎臟中MDA含量顯著升高，而同時期3臟器中SOD、GPx活性不同程度升高，GSH含量卻顯著下降的現象。綜合考慮，推測此時3臟器產生ROS的速率超出了抗氧化酶及GSH清除的速率，造成了氧化損傷，故其中的MDA含量上升。至于0.07、0.22 mg·L-1組鰓中的MDA含量不升反降，可能是由于草魚在Hg2+的脅迫下，體內產生的ROS誘導其中的SOD 、GPx活性升高，從而抑制了鰓細胞的脂質過氧化作用，且鰓中SOD活性要比其他器官高，從而導致了其MDA的下降。黃志斐等[16]的研究也佐證了這一推論。

本試驗發現，SOD、GPx、GSH對Hg2+脅迫的響應不盡相同。如暴露1 d，0.37 mg·L-1組各組織器官中的SOD、GPx活性均有不同程度的升高，而GSH含量卻顯著低于對照組水平。同時，各組織器官對Hg2+的應激反應也不盡相同。如暴露12 d，0.22 mg·L-1組鰓中的GPx活性顯著低于對照組，而其他組織器官中的GPx活性均與對照組相當。這種差異的存在，表明Hg2+對草魚體內抗氧化指標的影響與臟器和抗氧化組分自身的特點有關，同時體現了Hg2+毒性作用的復雜性。Ahmad等[13]的研究結果也支持了這一觀點。

本試驗表明，Hg2+的脅迫能夠破壞草魚抗氧化功能的平衡，進而表現出毒性作用。低濃度短時間暴露對草魚的抗氧化能力具有促進作用，而高濃度長時間暴露則具有抑制作用。低濃度短時間暴露(0.07 mg·L-1、1 d)鰓中的SOD、GPx活性和GSH、MDA含量均發生顯著變化，說明鰓對Hg2+脅迫的響應較其他器官更為敏感。0.37 mg·L-1組各組織器官中MDA含量均顯著升高，表明該濃度能夠導致草魚抗氧化能力的下降。

本試驗從抗氧化能力的影響方面探究了Hg2+對草魚的毒性原理，SOD、GPx的活性及GSH、MDA的含量是否適合作為水環境中Hg2+的檢測指標還有待下一步的研究，即經接近于水環境的Hg2+濃度處理后，觀察草魚能否做出靈敏的規律性反應。鑒于鰓對Hg2+污染的應激較其他器官更為敏感，今后可以鰓為重點研究對象，采用其他針對性更強的指標，如金屬硫蛋白、相關基因等進行試驗，進而更加全面地揭示Hg2+的致毒機理。

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(責任編輯盧福莊)

EffectofHg2+onantioxidantfunctionofCtenopharyngodonidella

NIU Jingyan1， LIU Zhancai1，2，*

(1.InstituteofBiotechnology，JiaozuoTeacher’sCollege，Jiaozuo454001，China; 2.CollegeofFisheries，HenanNormalUniversity，Xinxiang453007，China)

This study was aimed to investigate the effect of Hg2+on antioxidant function of grass carp，Ctenopharyngodonidella. The experimental fish were divided into control and treatment groups. The control group fish were fed in normally cultivated water， and the treatment group fish were exposed to water containing Hg2+concentration of 0.07，0.22，0.37，0.52 mg·L-1， respectively. The superoxide dismutase (SOD)， glutathione peroxidase (GPx) activities as well as glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) contents in their gill， hepatopancreas， spleen and kidney were tested on 1， 5， 12， 21 d after treatment. The results were as follows: compared with the control group， during the experimental period， for the tested organ tissues， the SOD， GPx activities(0.52 mg·L-1)and GSH (0.37， 0.52 mg·L-1) contents decreased significantly (P<0.05)， while MDA contents (0.37， 0.52 mg·L-1) increased remarkably(P<0.05). When exposed to Hg2+for 1 d， the SOD， GPx activities (0.07， 0.22， 0.37 mg·L-1groups) and GSH contents (0.07， 0.22 mg·L-1groups) in the tested organ tissues rose in different degree， however， MDA content in gill fell dramatically (P<0.05). When exposed to Hg2+for 5 d， the SOD activities in gill， spleen， kidney (0.37 mg·L-1)， the GPx activities in gill， hepatopancreas， kidney (0.37 mg·L-1)， the GSH contents in the tested organ tissues (0.37 mg·L-1) reduced apparently (P<0.05)， and the same changes took place in the SOD， GPx activities (0.37 mg·L-1) when exposed to Hg2+for 12 d. When exposed to Hg2+for 21 d， the SOD ， GPx activities in the tested organ tissues (0.22， 0.37 mg·L-1) and GSH contents in the spleen and kidney(0.22 mg·L-1) dropped significantly (P<0.05)， nevertheless， MDA contents in the tested organ tissues (0.22 mg·L-1) increased greatly (P<0.05). It could be concluded that for grass carp， the antioxidant function was promoted by low Hg2+concentration in short time exposure， but inhibited by high Hg2+concentration in long time exposure. The experiment showed that the stress responses of the organ tissues and the antioxidant components were not the same under Hg2+stress， this might be due to the characteristics of the organ tissues and the components， but also reflected the complexity of Hg2+toxic effects.

Hg2+;Ctenopharyngodonidella; antioxidant function

S949；Q956

：A

：1004-1524(2017)09-1451-07

牛景彥，劉占才. 汞離子對草魚抗氧化功能的影響[J].浙江農業學報，2017，29(9): 1451-1457.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.05

2017-02-20

河南省重點科技攻關計劃項目(072102130027)；河南省高等學校重點科研項目(18B180017)；河南省教育廳自然科學研究計劃項目(2011C180009)

牛景彥(1979—),男,河南新鄉人，碩士, 講師, 主要從事環境效應和水生動物健康研究。E-mail：laoniu526@sohu.com

*通信作者，劉占才，E-mail：zcliu1206@163.com