核桃楸丙酮提取物的穩(wěn)定性及抑菌活性

王天淼，孫墨瓏

(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040)

核桃楸丙酮提取物的穩(wěn)定性及抑菌活性

王天淼，孫墨瓏*

(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，哈爾濱 150040)

采用超聲法和紫外分光光度法提取和測定核桃楸葉和外果皮丙酮提取物的單寧含量，以單寧降解率作為評價(jià)指標(biāo)，考察溫度和光照等因素對核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：以體積分?jǐn)?shù)50%丙酮-水溶液為浸提液，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間40 min，料液比1∶15，超聲波提取核桃楸葉和外果皮單寧含量分別為38.6 mg/g和35.4 mg/g。隨著溫度升高或強(qiáng)光照射，核桃楸丙酮提取物中的單寧降解率增加，穩(wěn)定性降低。核桃楸葉丙酮提取物的穩(wěn)定性略高于外果皮丙酮提取物。同時(shí)采用牛津杯法研究核桃楸葉和外果皮丙酮提取物對木材腐朽菌的抑菌效果。結(jié)果表明：核桃楸葉和外果皮丙酮提取物對木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩絨革蓋菌均有抑菌活性。核桃楸葉和外果皮丙酮提取物對密粘褶菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)均為1.50 g/L，對彩絨革蓋菌的MIC均為2.00 g/L。核桃楸丙酮提取物對密粘褶菌的抑菌活性略優(yōu)于彩絨革蓋菌。核桃楸葉和外果皮丙酮提取物適合于中性條件下室溫避光貯存和使用。

核桃楸；穩(wěn)定性；抑菌活性；提取；單寧

0 引言

核桃楸(JuglansMandshuricaMaxim.)，為胡桃科胡桃屬落葉喬木，主要分布于我國東北地區(qū)(小興安嶺及張廣才嶺)，是東北闊葉紅松林重要的伴生樹種，也是重要的藥源植物。對具有生物活性成分的木本藥源植物進(jìn)行研究與利用，具有廣闊的研究空間和應(yīng)用前景。核桃楸外果皮中含有單寧、胡桃醌、α-和β-氫化胡桃葉醌等，葉片中的主要成分為沒食子酸、胡桃葉醌和多酚復(fù)合物等[1-2]。胡桃醌是核桃楸中主要的毒性物質(zhì)，相對含量較高[3]。植物單寧，又稱植物多酚，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的天然多酚類物質(zhì)。許多植物的葉、樹皮和種皮等部位中都含有豐富的單寧，其獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)源于自身的多酚羥基結(jié)構(gòu)[4-5]。植物提取物中的活性成分是植物的一類或幾類次生代謝物質(zhì)，植物提取物的穩(wěn)定性受溫度和光照等因素的影響[5]。目前對核桃楸的研究主要關(guān)于外果皮、葉、樹皮中化學(xué)成分、胡桃醌及總黃酮含量、乙醇提取物的抑菌和殺蟲活性等方面[7-16]。關(guān)于核桃楸丙酮提取物的穩(wěn)定性及其抑菌活性未見報(bào)道。本研究采用超聲波提取核桃楸葉和外果皮中的單寧。以單寧降解率作為評價(jià)指標(biāo)，考察溫度和光照等因素對核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的影響，考察丙酮提取物對木材腐朽菌的抑菌活性，以期為核桃楸葉和外果皮的研究與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試驗(yàn)用的核桃楸葉和外果皮樣品采于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場。木材褐腐菌密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)和白腐菌彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)來自東北林業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)室。試劑：單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國SIGMA公司)；其他試劑均為分析純。儀器：TU-1901紫外分光光度計(jì)；KQ3200DE數(shù)控超聲波振蕩儀；YXQ-LS-30SII高溫蒸汽滅菌鍋；HSX-450恒溫恒濕培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

單寧含量測定方法采用磷鉬酸-磷鎢酸比色法(F-D法)進(jìn)行測定[17]。精確配制0.100 g/L單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。分別量取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5個(gè)干燥的容量瓶中，分別加入F-D試劑2 mL，飽和Na2CO3溶液10 mL，定容50 mL。放置30 min顯色，用紫外分光光度計(jì)測定654 nm處的吸光度。以吸光度值與標(biāo)樣濃度的關(guān)系建立單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 核桃楸葉和外果皮丙酮提取物中單寧的含量測定

稱取核桃楸葉和外果皮粗粉各2.00 g，以體積分?jǐn)?shù)50%的丙酮-水溶液為浸提液，在超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間40 min，料液比1∶15的條件下提取核桃楸樣品。收集3次浸提液，定容至100 mL。分別量取核桃楸葉和外果皮的單寧提取液1.0 mL，參照單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定方法測定溶液吸光度。

1.2.3 溫度和光照影響核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的測定方法

將濃度為20.0 g/L的核桃楸葉和外果皮50%丙酮-水溶液提取液置于7個(gè)系列50 mL容量瓶中，每系列設(shè)2組平行樣，參照單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定方法測定各溶液的吸光度。然后蠟封，5個(gè)系列分別置于15、25、35、45、55℃恒溫條件下放置，2個(gè)系列分別置于4 000 Lx強(qiáng)度的光照下(各每天光照8 h)放置。3、6、9、14 、21 d后測定各溶液的吸光度，每系列取平均值，計(jì)算單寧含量[18]。以單寧降解率作為指標(biāo)，考察溫度和光照對核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的影響。單寧降解率計(jì)算公式為：

(1)

1.2.4 核桃楸丙酮提取物的抑菌活性測定

采用牛津杯法測定核桃楸葉和外果皮丙酮提取物的抑菌效果[19]。將已滅菌的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)10 mL熔化倒入培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，每皿對稱打入4只滅菌牛津杯(直徑為7.9±0.1 mm)，倒入含有菌液的PDA，至培養(yǎng)基高度恰好與牛津杯上端持平，凝固后用鑷子輕輕取出牛津杯。在牛津杯留下的空洞里分別注入0.50～3.00 g/L共6個(gè)濃度的丙酮提取液1 mL，丙酮溶劑作空白，密封后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 核桃楸葉和外果皮丙酮提取物中單寧的含量

參照單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線，核桃楸葉和外果皮50%丙酮-水溶液提取物的單寧含量分別為38.6 mg/g和35.4 mg/g。

2.2溫度對核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的影響

溫度對核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的影響見表1。

表1 溫度對核桃楸丙酮提取物穩(wěn)定性的影響

由表1可以看出，隨著溫度升高，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物中的單寧降解率增大，穩(wěn)定性降低。55℃放置21 d時(shí)，單寧降解率高于20%，穩(wěn)定性差。不同溫度時(shí)，單寧降解率與放置時(shí)間均呈對數(shù)關(guān)系，具有一級反應(yīng)的特征[18]。穩(wěn)定性回歸分析表明，溫度為55℃時(shí)，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物單寧降解率達(dá)到50%時(shí)所需時(shí)間分別為53.4 d和49.6 d。

2.3光照對核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的影響

光照對核桃楸葉和外果皮丙酮提取物穩(wěn)定性的影響見表2。

表2 光照對核桃楸丙酮提取物穩(wěn)定性的影響

由表2可以看出，強(qiáng)光照射時(shí)間越長，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物中的單寧降解率增大，穩(wěn)定性降低。強(qiáng)光照射放置21 d時(shí)，單寧降解率高于20%，穩(wěn)定性差。強(qiáng)光照射時(shí)，單寧降解率與放置時(shí)間均呈線性關(guān)系，具有零級反應(yīng)的特征[18]。穩(wěn)定性回歸分析表明，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物單寧降解率達(dá)到50%時(shí)所需時(shí)間分別為43.6 d和38.7 d。

2.4 核桃楸葉和外果皮丙酮提取物的穩(wěn)定性比較

55℃和強(qiáng)光照射時(shí)，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物的穩(wěn)定性比較如圖1所示。

圖1 55℃和強(qiáng)光照射時(shí)核桃楸丙酮提取物 的穩(wěn)定性比較Fig.1 Stability comparison of the acetone extracts on Juglans mandshurica at 55℃ and with sunshine

由圖1可以看出，核桃楸葉丙酮提取物的穩(wěn)定性略高于外果皮丙酮提取物。核桃楸葉和外果皮丙酮提取物適合于中性條件下室溫避光貯存和使用。

2.5 核桃楸丙酮提取物的抑菌活性測定結(jié)果

核桃楸葉和外果皮丙酮提取物對木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩絨革蓋菌的抑菌活性測定結(jié)果見表3。

表3 核桃楸丙酮提取物抑菌活性測定結(jié)果

由表3可以看出，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物對木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩絨革蓋菌均有抑菌活性。核桃楸葉和外果皮丙酮提取物對密粘褶菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)均為1.50 g/L，對彩絨革蓋菌的MIC均為2.00 g/L。核桃楸丙酮提取物對密粘褶菌的抑菌活性略優(yōu)于彩絨革蓋菌。

多酚類物質(zhì)容易發(fā)生氧化或降解，而且在植物體內(nèi)常與黃酮類、醌類、簡單酚和木質(zhì)素等以化學(xué)鍵結(jié)合共存。不同植物以及同種植物不同器官中的單寧，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同使得其用途也各不相同。核桃楸單寧為水解類單寧，是由酸及其衍生物與葡萄糖或多元醇主要通過酯鍵形成的化合物，其容易被酸(或酶)水解為糖、多元醇和酚性羧酸[4]。

單寧分子中大量的酚羥基和芳香環(huán)結(jié)構(gòu)可以與酶的肽基、氨基及羧基等以氫鍵的形式發(fā)生多點(diǎn)結(jié)合，抑制微生物酶的活性，對微生物膜造成一定的損傷[20-21]。由于植物單寧存在著化學(xué)性質(zhì)極為相似的同系物，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，且單寧的異質(zhì)性隨著其聚合度的增大而增加，使得植物單寧聚合物的分離和結(jié)構(gòu)分析有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

超聲波提取核桃楸葉和外果皮單寧含量分別為38.6 mg/g和35.4 mg/g。隨著溫度升高，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物中的單寧降解率增大，穩(wěn)定性降低。55℃放置21 d時(shí)，單寧降解率高于20%，穩(wěn)定性差。不同溫度時(shí)，單寧降解率與放置時(shí)間均呈對數(shù)關(guān)系，具有一級反應(yīng)的特征。通過穩(wěn)定性回歸分析，溫度為55℃時(shí)，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物單寧降解率達(dá)到50%時(shí)所需時(shí)間分別為53.4 d和49.6 d。強(qiáng)光照射時(shí)間越長，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物中的單寧降解率增大，穩(wěn)定性降低。強(qiáng)光照射放置21 d時(shí)，單寧降解率高于20%，穩(wěn)定性差。強(qiáng)光照射時(shí)，單寧降解率與放置時(shí)間均呈線性關(guān)系，具有零級反應(yīng)的特征。通過穩(wěn)定性回歸分析，核桃楸葉和外果皮丙酮提取物單寧降解率達(dá)到50%時(shí)所需時(shí)間分別為43.6 d和38.7 d。核桃楸葉丙酮提取物的穩(wěn)定性略高于外果皮丙酮提取物。核桃楸丙酮提取物對木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩絨革蓋菌均有抑菌活性。核桃楸葉和外果皮丙酮提取物對密粘褶菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)均為1.50 g/L，對彩絨革蓋菌的MIC均為2.00 g/L。核桃楸丙酮提取物對密粘褶菌的抑菌活性略優(yōu)于彩絨革蓋菌。核桃楸葉和外果皮丙酮提取物適合于中性條件下室溫避光貯存和使用。植物單寧聚合物的分離和結(jié)構(gòu)分析有待進(jìn)一步研究。

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StabilityandAntifungalActivitiesofAcetoneExtractsonJuglansmandshurica

Wang Tianmiao，Sun Molong*

(College of Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040)

In order to investigate the stability and antifungal activities of acetone extracts on Juglans mandshurica，ultrasonic and UV spectrophotometry method were used to extract and determine the tannins content of acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica.Taking the tannin degradation rate as the evaluation index，the effects of temperature and sunshine on the stability of acetone extracts were studied.Results showed that the optimal extraction conditions were the volume fraction of acetone 50% with water，ultrasonic temperature of 50 ℃，extraction time of 40 min，solid-liquid ratio of 1∶15，the tannins contents were 38.6 mg·g-1and 35.4 mg·g-1with leaves and green peel of Juglans mandshurica respectively.With the increase of temperature or strong sunshine，the degradation rate of tannin increased and the stability decreased.The stability of acetone extract of leaves was slightly higher than that of green peel.The cylinder-plate method was used to evaluate the antifungal effect for wood-rooting fungi of the acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica.Results showed that acetone extracts of Juglans mandshurica had antifungal activities for wood-rotting fungi of both Gloeophyllum trabeum and Coriolus versicolor.MIC of the acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica were both 1.50 g/L for Gloeophyllum trabeum，and both 2.00g/L for Coriolus versicolor.The antifungal activity for Gloeophyllum trabeum was better than that for Coriolus versicolor.The acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica are suitable storage and use for neutral condition at room temperature and away from light.

Juglansmandshurica；stability；antifungal activities；extraction；tannins

S 792；Q 946

：A

：1001-005X(2017)05-0041-04

2017-05-29

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572015BB18)

王天淼，碩士，助理工程師。研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。tmwang@nefu.edu.cn

孫墨瓏，博士，教授。研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：molongsun@126.com

王天淼，孫墨瓏.核桃楸丙酮提取物的穩(wěn)定性及抑菌活性[J].森林工程，2017，33(5)：41-44.