腐生葡萄球菌脂肪酶3制備及酶活性研究

羅健，焦洋，楊彥鳳

(1.重慶子勻環保工程有限公司，重慶 400039；2.中國兵器工業第五九研究所，重慶 400039)

腐生葡萄球菌脂肪酶3制備及酶活性研究

羅健1，焦洋1，楊彥鳳2

(1.重慶子勻環保工程有限公司，重慶 400039；2.中國兵器工業第五九研究所，重慶 400039)

克隆得到腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3編碼基因，構建了Pet28-Ss-Lip3表達質粒，在大腸菌株中獲得腐生葡萄球菌脂肪酶3的高效上清表達，應用Ni2+-NTA親和層析柱獲得了純度約90%的重組脂肪酶，分子篩檢測發現其在溶液中主要以單體形式存在。酶活性分析純化后的脂肪酶最適宜的反應pH值為7.0，溫度為40 ℃。結果表明，腐生葡萄球菌脂肪酶3的堿性和溫度耐受性較好，有望通過定點突變獲得更好適應性的脂肪酶。

脂肪酶；腐生葡萄球菌；純化；酶活性

微生物在傳統污水處理中扮演著重要角色，但生物制藥、石油化工等新興行業污水成分復雜多樣，一般的微生物對于高難度、高濃度的廢水束手無策。近年來，利用定向進化技術和基因工程技術篩選出具有靶向性的生物酶制劑，能夠有針對性地降解傳統生物處理方法無法降解的污染物。其中，脂肪酶(Lipase, EC 3.1.1.3)，又名甘油酯水解酶，屬羧基酯水解酶類，能在油水界面上水解甘油三酯中酯鍵，可以催化長鏈或短鏈、飽和或不飽和酯的水解，廣泛應用于環保、食品、皮革、洗滌劑、醫藥以及生物柴油等工業領域[1,2]。大多數脂肪酶在乙醇溶液中醇解三酰基甘油，而不是甲醇，因為很多的酶在甲醇中會失去酶活性[3]。目前發現的脂肪酶在室溫環境下的活性很低，酶的穩定性和pH值范圍比較小，影響了其推廣使用[4-5]。本文以腐生葡萄球菌脂肪酶為研究對象，克隆了腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)的脂肪酶3編碼基因，在大腸桿菌系統表達并純化了腐生葡萄球菌脂肪酶，并對其活性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1粒、菌種及培養條件

質粒pET28a購買Novagen。大腸桿菌(E.coli) DH5α和BL21(DE3)用于質粒的構建和脂肪酶表達。所有菌株培養均采用Luria-Bertani(LB)培養基，于37 ℃培養。根據試驗需要，向LB培養基中添加卡那霉素(終濃度50 μg /mL)。向LB 培養基中添加終濃度為20 μg /mL的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行脂肪酶表達誘導。

1.1.2試劑

LB 培養基各配料購自英國Oxoid公司，PCR用高保真DNA聚合酶購自Takara公司，各限制性內切酶和DNA 連接酶等購自Takara公司，DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，低分子量蛋白質標準和DNA分子量標準購自Fermentas公司。其他試劑均為市售分析純試劑。

1.2方法

1.2.1分子生物學方法

分子生物學操作如E.coli感受態細胞的制備、質粒DNA 的抽提及純化、限制性酶切、DNA 片段的連接和轉化、PCR、核酸凝膠電泳和蛋白質SDS-PAGE電泳等操作按文獻進行，枯草芽孢桿菌的感受態細胞制備和轉化按文獻進行。

1.2.2基因克隆

以腐生葡萄球菌M36基因組DNA 為模板，采用引物forward primer (5’-CTAGGATCCATGCAGATTAAACTTCCAGAACC-3’)(下劃線為BamHI)和reverse primer(5’-TCACTCGAGTTAATTCGACCAATCTAATGATTC-3’)(下劃線為XhoI)進行PCR 擴增，PCR 反應條件為: 預變性(94 ℃，8 min)，變性(94 ℃，30 s)、退火(60 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，50 s)，共20個循環。將PCR產物進行純化回收，與載體pET28a分別在37 ℃水浴進行BamHI和XhoI雙酶切3 h，然后使用T4 DNA連接酶將目的基因與載體在16 ℃水浴進行過夜連接。然后轉化到克隆菌株大腸桿菌(E.coli) DH5α中，從轉化后的LB平板上挑選多個單克隆菌，依次接種于LB液體培養基中(5 mL，卡那霉素抗性)，放置于震蕩培養箱中培養(37 ℃，200 rpm)至OD600為0.2，挑取菌液為模板進行PCR鑒定。繼續培養PCR鑒定為陽性的菌液至OD600為0.8～1.0，收集細菌并提取質粒。將提取的質粒BamHI和XhoI進行雙酶切(37 ℃，4 h)，瓊脂糖電泳鑒定雙酶切結果。將酶切鑒定陽性結果送生物技術有限公司進行測序驗證。得到的重組質粒命名為Pet28-Ss-Lip3。

1.2.3化表達菌及誘導表達脂肪酶

將Pet28-Ss-Lip3質粒轉化大腸桿菌(BL21)，再接種于LB平板上(卡那霉素抗性)，放置于37 ℃溫箱中過夜培養；從LB平板上挑選過個單克隆菌，依次接種于LB培養基中(200 mL，卡那霉素抗性)，放置于震蕩培養箱中培養(37 ℃，200 rpm)至OD600為0.4～0.6，加入IPTG(終濃度為0.1 mM)后放入搖床于低溫(20 ℃，200 rpm)誘導培養20 h。

1.2.4肪酶純化

低溫離心(4 ℃，4000 rpm)15 min收集菌體，加入Lysis 緩沖液(PBS，100 mM，pH 7.4；NaCl，300 mM)攪拌均勻后冰水浴中超聲破碎至菌液清涼；低溫高速離心(4 ℃，12000 rpm)30 min收集上清，低速穿過預平衡的Ni2+-NTA親和層析柱；先后分別用10柱體積Lysis 緩沖液和Washing緩沖液(PBS，100 mM， pH 7.4；NaCl，300 mM；20 mM、30 mM和40 mM咪唑)先后分別洗脫非特異結合蛋白質，最后用Elution緩沖液(PBS，100 mM，pH 7.4；NaCl，300 mM；200 mM咪唑)洗脫目的蛋白質。

純化結果用SDS-PAGE電泳驗證，然后將目的蛋白質用超濾緩沖液(PBS，5 mM，pH 7.4；50 mM NaCl)稀釋脫鹽并超濾濃縮至濃度約1 mg/L, 分裝后于-80 ℃保存。分子篩(Superdex 200)用牛白蛋白V (66.2 kDa)、雞白蛋白(44.2 kDa)、糜蛋白酶原A (24.5 kDa)和溶菌酶(14.4 kDa)進行標定。重組腐生葡萄球菌M36脂肪酶3的洗脫體積為80.1 mL，對應溶液中分子量為鑒定溶液中分子量，標準分子19.2 kDa。

1.2.5酶活性鑒定

脂肪酶活性檢測方法參考Ratnaningsih等的方法，脂肪酶的活性檢測以PPNP(棕櫚酸對硝基苯酯)為底物[6-7]。將0.9 mL 0.1MpPNP與0.1 mL脂肪酶溶液進行混合，并于55 ℃孵育，于410 nm檢測產物pNP(對硝基苯酚)的吸收峰。酶活單位定義為：在pH 8.0，37 ℃條件下，以pNPP為底物，1 min內水解產生1 μM的pNP所需的脂肪酶量定義為一個酶活力單位U。

酶的最適pH值的范圍為4.0～10.0，緩沖液體系分別為：檸檬酸緩沖液(pH 4.0～6.0)，Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～8.0)，甘氨酸緩沖液(pH 9.0～10.0)。pH值穩定性實驗是將酶反應體系在40 ℃相應的pH值緩沖液中孵育30 min后的檢測活性。最適溫度檢測范圍為25～60 ℃，反應的緩沖體系為Tris-HCl緩沖液pH 7.0，脂肪酶熱穩定性為在相應的溫度下孵育30 min后的檢測活性。

2 實驗結果

2.1基因克隆與表達質粒構建

以本實驗室保存的腐生葡萄球菌M36提取的基因組為模板，PCR擴增(圖1A)后進行雙酶切，然后雙酶切后的pET28a載體進行連接，挑選陽性克隆進行PCR鑒定和雙酶切鑒定(圖1B和1C)，送生物公司DNA序列測定。結果顯示，沒有發生移碼和突變。

圖1 脂肪酶基因克隆與表達質粒構建Fig.1 Gene cloning and plasmid construction of Staph. saprophyticus lipase 3

2.2表達與純化目的蛋白質

超聲破碎得到的上清液的SDS-PAGE結果顯示，目的蛋白質在大腸桿菌BL21中大量表達，且以可溶性蛋白質形式表達(圖2泳道1和2)。用Elution緩沖液洗脫后用SDS-PAGE驗證，目的蛋白質純度約90%(圖2泳道8)。分子篩superdex200洗脫顯示，重組腐生葡萄球菌M36脂肪酶3為單洗脫峰，對應溶液中分子量約為19.2 kDa，證明其在溶液中主要單體形式(monomer)存在。

圖2 脂肪酶的表達與純化Fig.2 Expression and purification of SDS-PAGE analysis of Staph. saprophyticus lipase 3

圖3 分子篩層析圖Fig.3 Chart of size exclusion chromatography

2.3目的蛋白質脂肪酶活性鑒定

純化后的脂肪酶最適宜的反應pH值為7.0，但是該重組酶能夠在堿性緩沖液體系(pH 9.0～10.0)催化降解p-NPP(圖4A)，而且在40 ℃反應溫度下，30 min后仍然保持了約40%的酶活性(圖4B)。

純化后的重組脂肪酶的最適宜反應溫度為35～40 ℃，但是在反應溫度為60 ℃時，仍能保持30%的活性，即使在30 min后，同樣能夠保持20%的活性。

上述結果顯示，腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3具有對pH值和溫度的適應范圍比較廣，在相對極端的條件下，仍然保持有較好的酶活性。

圖4 脂肪酶3的酶活性測定Fig.4 Activity and stability of purified recombinant Staph. saprophyticus lipase 3

3 討論

本研究制備重組腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3屬于堿性脂肪酶，在高pH值(pH 10.0)情況下仍然具有約70%的酶活性(圖3A)。Nthangeni等發現重組地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)脂肪酶的最適宜pH值為10.0～11.5[8]，重組的Bacillussp. HH-01脂肪酶在pH 4.0～11.0具有穩定的酶活性[9]，B.amyloliquefaciensNsic-8脂肪酶對堿性環境也有一定的適應性[10]。Nthangeni等認為除了這些脂肪酶本身具有耐堿性結構外，位于重組蛋白質氨基或者羧基端的His-Tag提升了對堿性環境的耐受性[8]。

Bacillussp. HH-01脂肪酶的最適宜溫度為30 ℃，B.amyloliquefaciensNsic-6脂肪酶在20～60 ℃具有較高的酶活性，而本研究報道的腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3在40 ℃活性最高，比以前報道的堿性脂肪酶具有更好的高溫適應性[19-20]。腐生葡萄球菌M36脂肪酶3分子篩顯示其在溶液中以單體形成存在，表明沒有形成分子間二硫鍵。該脂肪酶氨基酸一級序列分析發現，僅在37Cys和118Cys位存在2個半胱氨酸，表明這一對半胱氨酸可能形成分子間二硫鍵，但是目前尚缺乏該脂肪酶的三維結構的進一步確認。下一步將進行腐生葡萄球菌M36脂肪酶3的三維結構解析，闡明其堿性和溫度耐受性的分子基礎，有望通過定點突變實現定向進化而獲取具有更好適應性的脂肪酶。

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Study on Purification and Enzymic Activity of Lipase3from Staph. saprophyticus M36

LUO Jian, JIAO Yang, YANG Yan-feng

(1.Chongqing Ziyun Environment Engineering Co., Ltd., Chongqing 400039, China; 2.No. 59 Institute, China Ordnance Industry, Chongqing 400039, China)

The lipase gene from Staph.saprophyticus M36 was cloned into pet28a vector. The recombinant lipase 3 was expressed in the supernatant of theEcolilysate. The lipase was purified by Ni2+-NTA affinity column with about 90% purity. The size exclusion chromatography experiment confirmed that Lipase 3 existed as monomer in solution. The optimum pH and temperature of the recombinant lipase were 7.0 and 40 ℃, respectively. Collectively, the recombinant lipase 3 had excellent tolerance for alkaline buffer and temperature, implying it was a good candidate for directed evolution to solution to lipase for commercial purposes.

lipase;Staph.saprophyticus; purification; enzymic activity

10.14068/j.ceia.2017.05.020

X172

： A

： 2095-6444(2017)05-0093-04

2017-05-24

羅健(1971—)，男，四川瀘縣人，工程師，主要研究方向為環境工程微生物，E-mail：673359479@qq.com

焦洋(1978—)，男，貴州貴陽人，工程師，碩士，主要研究方向為工業廢水處理，E-mail：122089103@qq.com