侵染芹菜的甜椒內源RNA病毒鑒定及序列分析

趙興華, 于沛俠, 陳麗君, 王德富, 牛顏冰*

(1. 河南省濟源市農牧局園藝工作站,濟源459000; 2. 山西農業大學生命科學學院,太谷 030801)

侵染芹菜的甜椒內源RNA病毒鑒定及序列分析

趙興華1, 于沛俠2, 陳麗君2, 王德富2, 牛顏冰2*

(1. 河南省濟源市農牧局園藝工作站,濟源459000; 2. 山西農業大學生命科學學院,太谷 030801)

本試驗利用雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)提取技術和非序列依賴PCR擴增(sequence-independent amplification,SIA)方法對表現皺縮癥狀的芹菜進行分子鑒定,發現芹菜被甜椒內源RNA病毒Bellpepperalphaendornavirus(BPEV)所侵染。為進一步明確山西芹菜BPEV分離物(BPEV-QC,GenBank登錄號為KY659226)的分類地位,根據SIA測序結果設計BPEV特異性引物進行RT-PCR檢測,并進行序列相似性比較和系統進化分析。序列同源性分析表明:BPEV-QC與BPEV分離物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW)的同源性為80.0%～97.8%,與其他內源RNA病毒科分離物的同源性僅為30.6%～37.6%,表明:BPEV-QC與BPEV分離物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj)形成一個獨立分支,親緣關系最近。

芹菜; 病原鑒定; 甜椒內源RNA病毒; 序列分析

芹菜Apiumgraveolens為傘形科植物,具有一定的藥用功效。近年來,隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強,對芹菜的需求量也在不斷增加,種植規模不斷擴大引起的病毒病危害也愈發普遍,嚴重影響了芹菜的產量和品質。目前芹菜主要受到黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)[1]、煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)、蠶豆萎蔫病毒Broad bean wilt virus (BBWV)、歐洲防風花葉病毒Parsnipmosaicvirus(ParMV)[2]、芹菜花葉病毒Celerymosaicvirus(CeMV)[3]、苜?；ㄈ~病毒Alfalfamosaicvirus(AMV)[4]、花生矮化病毒Peanutstuntvirus(PSV)、南芥菜花葉病毒Arabismosaicvirus(ArMV)、草莓潛環斑病毒Strawberrylatentringspotvirus(SLRSV)、番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus(TAV)[5]、芹菜黃花葉病毒Celery yellow mosaic virus (CeYMV)和蕪菁花葉病毒Turnipmosaicvirus(TuMV)等病毒的單獨或復合侵染。

筆者于2014年9月對山西晉中地區芹菜進行病害調查時,發現許多芹菜植株表現出嚴重皺縮癥狀,有的田塊病株率甚至高達60%。為明確引起芹菜皺縮癥狀的病原,本試驗利用dsRNA技術[6]和SIA方法[7]對采集的疑似病毒病樣品進行分子鑒定,結果發現芹菜受到BPEV侵染,將其命名為BPEV-QC,并對BPEV-QC的部分序列進行了克隆和系統進化分析,明確了其分類地位,這為進一步獲得甜椒內源RNA病毒山西芹菜分離物(BPEV-QC)的基因組全序列奠定了一定的基礎,也為芹菜病毒病的防治工作提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

表現皺縮癥狀的芹菜植株葉片病樣采自山西太谷韓村(圖1)。

圖1 芹菜田間發病癥狀Fig.1 Symptoms of diseased Apium graveolens in the field

1.2 方法

1.2.1 植物病原dsRNA的提取

參照牛顏冰等[8-9]和Tzanetakis等[6]的方法提取表現皺縮癥狀的芹菜病葉dsRNA。

1.2.2 樣品SIA和RT-PCR檢測

以提取的病樣dsRNA為模板,用XTN269引物反轉錄獲得病毒cDNA,再利用XTN177引物進行SIA檢測,反應體系和程序參照牛顏冰等[10]的方法。明確芹菜病毒病原后,根據NCBI上已收錄的BPEV分離物保守區設計特異引物對病毒部分序列進行RT-PCR擴增,同時以健康植株為陰性對照。所使用的隨機引物序列與特異引物序列見表1。

表1PCR擴增所用引物序列

Table1SequencesofprimerpairsusedforSIAandRT-PCRamplification

引物名稱Primername引物序列(5′?3′)Primersequence(5′?3′)XTN269AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGNNNNNNXTN177AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGBPEV?FTGGTCACGAAACGGTATTGABPEV?RTTTGTAGCAAGGGGTGCTCT

1.2.3 PCR產物克隆及序列分析

PCR產物純化回收后進行連接和轉化,隨機選取3個經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行測序。測序結果利用NCBI中的BLAST檢索同源序列;序列相似性采用DNAMAN 6.0軟件進行分析;利用MEGA 5.2軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 樣品SIA檢測結果

以XTN177為引物,以反轉錄得到的cDNA為模板進行SIA擴增,得到大小為799 bp的片段,而健康樣品未擴增出相應大小的條帶(圖2)。測序結果經BLAST同源性比較發現其與已報道的BPEV分離物的相似性最高,為80.0%～97.8%,初步證明芹菜被BPEV所侵染,并將其命名為BPEV-QC。

圖2 芹菜病樣SIA擴增產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis of SIA products of diseased Apium graveolens leaves

2.2 樣品RT-PCR檢測

為進一步確定侵染芹菜的病毒病原,以cDNA為模板,以BPEV-F/BPEV-R為引物進行特異性擴增,獲得大小為1 092 bp的目的片段(圖3),而健康樣品中未擴增出相應大小的片段,說明引起芹菜皺縮癥狀的病毒為BPEV。

2.3 BPEV-QC與內源RNA病毒科其他分離物的序列相似性

利用DNAMAN 6.0軟件對BPEV-QC分離物和其他13個內源RNA病毒科分離物(表2)進行核苷酸序列同源性分析,結果表明分離物BPEV-QC與其他內源RNA病毒分離物的核苷酸同源性在30.6%～97.8%之間,其中與BPEV分離物IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW的同源性較高,在80.0%～97.8%之間,與來自以色列IS的同源性最高,為97.8%,與來自美國的BPEV-YW同源性最低,為80.0%,而與其他內源RNA病毒科分離物同源性比較低,為30.6%～37.6%。

圖3 芹菜病樣RT-PCR檢測結果Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR products of Apium graveolens leaves

表2 BPEV-QC與已報道的13個內源RNA病毒分離物核苷酸同源性比較1)

1) “-”表示未知。 “-” unknown.

2.4 BPEV-QC系統進化分析

為進一步明確BPEV-QC的起源與進化關系,使用MAGE 5.2軟件對該分離物和已報道的其他13個來源不同的內源RNA病毒科分離物構建系統進化樹(圖4)。從系統進化樹中可以看出,BPEV-QC與其他BPEV分離物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj)形成一個大的分支,聚為一簇,這進一步說明BPEV-QC屬于BPEV分離物。

3 討論

植物病毒素稱植物“癌癥”,作為傘形科蔬菜的主要病害之一,常常導致芹菜產量降低和品質變劣。筆者2014年對山西晉中地區芹菜進行病害調查時發現田間病毒病害發生較為普遍,部分田塊病株率甚至高達70%。為明確其具體病毒病原,本研究利用雙鏈RNA技術和SIA檢測方法對芹菜病株進行了分子鑒定,發現感病芹菜受到甜椒內源RNA病毒的侵染,該結果為芹菜病毒病害的有效防治提供了一定的依據。

內源RNA病毒自第一次從蠶豆中發現以來,其寄主范圍在不斷擴大,包括植物[11]、真菌[12]和卵菌等。內源RNA病毒的基因組大小在9.8～17.6 kb之間[13-14],能獨立于宿主的基因進行復制[15]。內源RNA病毒屬Endornavirus是國際病毒分類委員會(ICTV)于2005年7月第八次病毒分類報告中新增的屬,其代表種是蠶豆內源RNA病毒[16-17],2012年第九次病毒分類報告中將其升級為內源RNA病毒科Endornaviridae[18],2016年國際病毒分類委員會又將Endornaviridae劃分為Alphaendornavirus和Betaendornavirus兩個屬(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)。甜椒內源RNA病毒是Alphaendornavirus屬的一個重要成員，其編碼的蛋白從N端到C端依次為病毒的甲基轉移酶、解旋酶、UDP-糖基轉移酶和依賴RNA的RNA聚合酶[19]。

圖4 BPEV-QC與已報道的其他13個內源RNA病毒分離物系統進化樹構建Fig.4 Phylogenetic tree of BPEV-QC and other 13 reported Endornaviridae isolates

大多數內源RNA病毒對宿主不引起任何病癥[13]。在一般情況下,低拷貝數的內源RNA病毒在植物宿主中依然可以通過種子高速率傳播[20-21]。然而,Ikeda等發現HmEV1是植物的弱毒力因子[22]。Osaki等發現VfEV與蠶豆雄性不育相關[23]?，F報道的BPEV宿主絕大部分為辣椒,Jo等通過辣椒轉錄組拼接出BPEV全長和部分片段,同時進行重組分析預測出BPEV-YW在4 852～5 363之間插入了Maor的部分片段[24]。本研究在芹菜上發現了BPEV,是否是由于重組導致侵染芹菜,還需進一步研究。

本研究從具有皺縮癥狀的芹菜中得到甜椒內源RNA病毒山西芹菜分離物(BPEV-QC),利用部分擴增序列進行了同源性比較和系統進化分析,發現BPEV-QC與BPEV IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW分離物的同源性在80.0%～97.8%之間,而與其他內源RNA病毒科分離物同源性較低,為30.6%～37.6%;系統進化分析表明BPEV-QC與BPEV IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj分離物形成一個獨立分支,親緣關系最近。但本試驗的結果是基于BPEV-QC部分序列的比較,無法精確地確立其種屬分類地位和變異進化關系,要想獲得更全面的基因信息,還需進一步擴增其全長序列,明確其具體的基因組結構,進而研究其致病機理和病害流行規律。

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(責任編輯： 楊明麗)

DetectionandsequenceanalysisofBellpepperalphaendornavirusinfectingApiumgraveolens

Zhao Xinghua1, Yu Peixia2, Chen Lijun2, Wang Defu2, Niu Yanbing2

(1.HorticulturalStationofJiyuanAgriculturalandAnimalHusbandryBureauinHenanProvince,Jiyuan459000,China;2.CollegeofLifeSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Viral pathogen that causedApiumgraveolenswrinkled disease, was identified by double-stranded RNA (dsRNA) extraction and sequence-independent amplification (SIA). The results of SIA and sequencing showed thatA.graveolenswas infected byBellpepperalphaendornavirus(BPEV). To further characterize the BPEV strain fromA.graveolens(BPEV-QC), specific primer pairs were designed for RT-PCR according to the results of SIA.Sequence alignments showed that BPEV-QC shared high homology (80.0%-97.8%) with BPEV isolates (IS, Maor, Kyosuzu, BPEV, lj, BPEV-YW), but shared low homology (30.6%-37.6%) with otherEndornaviridaeisolates, Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of BPEV-QC and otherEndornaviridaeisolates showed that BPEV-QC was most closely related toEndornaviridaeisolates (IS, Maor, Kyosuzu, BPEV, lj), and these isolates formed an independent branch.

Apiumgraveolens; pathogen identification;Bellpepperalphaendornavirus; sequence analysis

研究簡報ResearchNotes

S 436.3

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.023

2016-10-25

： 2017-01-10

公益性行業(農業)科研專項(201303028); 國家自然科學基金(31540050)

* 通信作者 E-mail: niuyanbingbest@163.com