急性應(yīng)激后小鼠空間學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)HIF—1α表達(dá)的變化

高曉曉+張雅普+李亞

【摘 要】目的 研究急性應(yīng)激強度下小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化以及海馬和前腦皮層HIF-1α的表達(dá)。方法 采用電擊足底方式對小鼠急性應(yīng)激處理，通過Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，采用免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠海馬和前腦皮層缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的表達(dá)。結(jié)果 急性應(yīng)激組小鼠在水迷宮實驗中的空間學(xué)習(xí)記憶能力比正常對照組小鼠明顯增強（P<0.05）；腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回和前腦皮層HIF-1α的表達(dá)顯著增加（P<0.01）。結(jié)論 急性應(yīng)激后，HIF-1α在海馬和前腦皮層表達(dá)增加，可能參與應(yīng)激引起小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的增強。

【關(guān)鍵詞】急性應(yīng)激；空間學(xué)習(xí)記憶；HIF-1α； 海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective To study the changes of spatial learning-memory ability after acute stress， and the expression of Hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） of prefrontal cortex （PFC） and hippocampus （HP） in mice brain. Methods The acute stress model mice with foot shock were applied. The spatial learning- memory in mice was determined by Morris water maze task， and the expression of HIF-1α in HP and PFC were observed by immunohistochemical method. Results Compared with the control group mice， the ability of spatial learning and memory in acute stress group mice were significantly increased （P<0.05）. The expression of HIF-1α in CA1， CA3 and dentate gyrus of HP and PFC were significantly enhanced in acute stress group mice （P<0.01）. Conclusion The enhancement of learning-memory function induced by acute stress in mice， which may be nearly associated with the up-regulated of HIF-1α expression in HP and PFC.

【Key words】acute stress； spatial learning and memory； HIF-1α； hippocampus； PFC

機體處于一定的社會環(huán)境中，總有類似的包括壓力、刺激、驚嚇、緊張等刺激使機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，由于這些刺激的強度、來源以及時間和頻率出現(xiàn)的不可預(yù)見性，將對人類的身心健康產(chǎn)生不同程度的影響。研究表明，適宜強度的應(yīng)激對于機體而言是有利的[1]，將有利于提高機體對外界刺激的警覺能力，使機體反應(yīng)更加敏銳，提高對周圍環(huán)境的適應(yīng)能力，有助于機體提高自身技能，包括對外界環(huán)境的探索能力以及部分腦區(qū)的高級活動，如學(xué)習(xí)記憶功能的改善。

研究表明，在接受外界不同程度的刺激過程中，體內(nèi)激素水平及相關(guān)蛋白表達(dá)會發(fā)生相應(yīng)的而變化。缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），是一種轉(zhuǎn)錄激活因子[2]，介導(dǎo)多種細(xì)胞和系統(tǒng)缺氧時的穩(wěn)態(tài)維持；研究表明，HIF-1α的下游靶基因如促紅細(xì)胞生成素（EPO）以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等皆為保護(hù)樣神經(jīng)因子[3]。本研究采用急性應(yīng)激處理小鼠，檢測小鼠在水迷宮中的空間學(xué)習(xí)記憶能力以及前腦皮層和海馬HIF-1α的表達(dá)，探討在一定的應(yīng)激強度下，小鼠學(xué)習(xí)記憶的改變與HIF-1α的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 動物分組及應(yīng)激方法

昆明品系小白鼠，3月齡，體重18～20g；雌雄各半。濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）20140007。購買后的小鼠于實驗室環(huán)境下適應(yīng)一周，提供充足的食物和水。急性應(yīng)激方法采用電擊足底，強度36v，30s/次，間隔15s刺激一次，共30次。對急性應(yīng)激組小鼠實施足底電擊，正常對照組小鼠不接受實驗應(yīng)激源，正常飼養(yǎng)。

1.2 Morris水迷宮檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力

采用Morris水迷宮檢測各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮由一圓形水池和一可移動隱匿的平臺組成，水池直徑80 cm，高50 cm，分為四個象限，平臺置于第一象限（目標(biāo)象限）。測試過程分兩部分：第一部分，定位航行實驗。實驗中將小鼠頭部用苦味酸染色，以使得實驗系統(tǒng)可以跟蹤到小鼠。小鼠從四個象限入水，記錄不同組小鼠從不同位置入水至爬上平臺所需要的時間，求得各組小鼠的逃避潛伏期（ escape latency），逃避潛伏期越短，小鼠空間學(xué)習(xí)能力越強。第二部分，空間搜索實驗。將平臺撤掉，將小鼠從第三象限入水，記錄小鼠在原平臺象限的停留時間。小鼠在原平臺象限停留時間越長，小鼠的空間記憶能力越強。

1.3 小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)和前腦區(qū)HIF-1α的表達(dá)

在水迷宮實驗結(jié)束后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用灌流取腦技術(shù)將小鼠的腦組織取出，經(jīng)多聚甲醛溶液中后固定2小時，PBS沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋等過程，切片后采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測小鼠相關(guān)腦區(qū)HIF-1α的表達(dá)情況。免疫組化過程均按照試劑盒（武漢博士德生物公司）說明進(jìn)行。最后選取每只小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回（DG）以及前腦皮層（PFC）切片3張，每張圖片隨機選取2個相應(yīng)部位。采用Motic Images Advanced3.2圖像處理系統(tǒng)計算HIF-1α陽性神經(jīng)元平均目標(biāo)灰度值。endprint

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采取平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SE）的方式來表示。其中，Morris水迷宮逃避潛伏期數(shù)據(jù)處理采用重復(fù)測量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳時間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間數(shù)據(jù)的比較采用Newman-Keuls法進(jìn)行分析；其他數(shù)據(jù)的組間比較采用非配對t檢驗， 以P <0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力檢測

定位航行實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析顯示（表1），正常對照組和急性應(yīng)激組小鼠的逃避潛伏期均迅速下降（F=6.378，P<0.01；F=8.546，P<0.01）。與正常對照組比較，急性應(yīng)激組小鼠的逃避潛伏期在第二、三和四訓(xùn)練周期，均明顯縮短，有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)果表明，急性應(yīng)激可增強小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。

空間搜索實驗中小鼠在各象限停留時間結(jié)果顯示（表2），正常對照組和急性應(yīng)激組小鼠在第一象限（目標(biāo)象限）停留的時間比其他三個象限的停留時間均顯著增長（F=5.783，P<0.05；F=9.675，P<0.01）；與正常對照組相比，急性應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限停留時間顯著增長（P <0.05）；而在目標(biāo)象限的相對象限（第三象限）停留時間明顯縮短（P<0.01）。結(jié)果表明，急性應(yīng)激可增強小鼠對原平臺記憶的保持能力。

2.2 各組小鼠海馬和前腦皮層HIF-1α的表達(dá)情況

各組小鼠HIF-1α表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色顯示，在海馬和前腦皮層都有廣泛表達(dá)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與正常對照組比較（表3），急性應(yīng)激組小鼠前腦皮層（PFC）和海馬CA1、DG區(qū)HIF-1α陽性神經(jīng)元平均目標(biāo)灰度值顯著減少（P<0.01，P<0.05，P<0.01），在CA3區(qū)差異不顯著。結(jié)果表明，急性應(yīng)激后小鼠海馬和前腦皮層HIF-1α的表達(dá)增強。

3 討論

相關(guān)研究顯示，適當(dāng)?shù)膽?yīng)激會提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而過強的應(yīng)激則會使小鼠和人的學(xué)習(xí)記憶能力低下[4]。研究表明，應(yīng)激會導(dǎo)致機體垂體-腎上腺皮質(zhì)及交感-腎上腺髓質(zhì)功能增強，明顯影響機體的學(xué)習(xí)和記憶能力[5]。也有研究顯示，慢性應(yīng)激導(dǎo)致動物學(xué)習(xí)記憶能力低下，空間學(xué)習(xí)記憶受損；這可能與應(yīng)激強度以及時長相關(guān)。我們實驗室先前的研究表明，急性應(yīng)激明顯增強小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，這種效應(yīng)可能與海馬和前腦皮層GDNF的表達(dá)密切關(guān)系[6]。本實驗結(jié)果表明，急性應(yīng)激后小鼠在Morris水迷宮中的逃避潛伏期顯著縮短，目標(biāo)象限停留時間明顯延長，說明急性應(yīng)激后小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著增強。

HIF-1在哺乳動物中廣泛表達(dá)，對氧氣的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起重要作用，是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白。受缺氧調(diào)控的 HIF-1α 是活性亞基，HIF-1α在常氧時合成和降解同時發(fā)生，經(jīng)脯氨酸羥化（Prolylhydroxylase，PHD）羥化修飾后降解，維持在低水平。有研究報道，在使用了HIF-1α的抑制劑PHD后，小鼠海馬記憶能力明顯提高；而癡呆模型大鼠的HIF、EPO表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶能力呈高度正相關(guān)[7]。研究表明，HIF-1α可通過 MAPK信號通路和PI3K/Akt信號通路表達(dá)調(diào)控其下游因子[8]。相關(guān)研究顯示，EPO mRNA的表達(dá)是以HIF的表達(dá)為基礎(chǔ)的，高劑量EPO有助于改善動物的學(xué)習(xí)記憶[9]，而在敲除HIF-1α基因后，VEGF等因子并不能被正常激活。本研究結(jié)果表明，急性應(yīng)激后，小鼠海馬各區(qū)和前腦皮層HIF-1α陽性神經(jīng)元平均灰度值明顯降低，海馬和前腦皮層HIF-1α的表達(dá)顯著增強。因此，可以推測，機體可能通過提高HIF-1α表達(dá)來激活其靶基因的表達(dá)如EPO以及VEGF等保護(hù)因子，來實現(xiàn)對學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Lupien SJ， McEwen BS， Gunnar MR， et al. Effects of stress throughout the lifespan on the brain， behaviour and cognition[J]. Nat Rev Neurosci， 2009， 10（6）： 434-445.

[2]Majmundar AJ， Wong WJ， Simon MC. Hypoxia inducible factors and the response to hypoxic stress[J]. Mol Cell， 2010， 40（2）： 294-309.

[3]湯盈，等.缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）對促紅細(xì)胞生成素（EPO）等靶基因表達(dá)的影響[J].四川體育科學(xué)，2006，（3）：26-29.

[4]嵇志紅，高偉.應(yīng)激對動物行為和學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].大連大學(xué)學(xué)報，2002，（4）： 81-84.

[5]McEwen BS. Protective and damaging effects of stress mediators： central role of the brain [J].Dialogues Clin Neurosci，2006，8（4）：367-381.

[6]陳亞靜，史建勛，張冠雄，等.急性應(yīng)激對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)GDNF表達(dá)的影響[J].科技信息.2012，9：24-25.

[7]張蓓，吳海琴，等.低氧誘導(dǎo)因子-1、促紅細(xì)胞生成素在血管性癡呆大鼠海馬的表達(dá)[J].四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，（5）：730-733.

[8]Cavadas MA， Nguyen LK， Cheong A. Hypoxia-inducible factor （HIF） network： insights from mathematical models [J]. Cell Commun Signal， 2013， 11：42.

[9]Adamcio B， Sperling S， Hagemeyer N， et al. Hypoxia inducible factor stabilization leads to lasting improvement of hippocampal memory in healthy mice [J].Behav Brain Research，2010，208（1）：80-84.

[責(zé)任編輯：張濤]endprint